液体活检在结直肠癌领域的研究及应用现状

崔雪阳 综述 邢承忠 审校

恶性肿瘤的发生主要是由于调控细胞增殖、分化的基因不断变异累积造成。一直以来，组织标本是癌症诊断的金标准，也是确定预后以及监测治疗的基石。通过组织样本获取的肿瘤分子表达谱不能反复获得，只能提供肿瘤异质性的“快照”，且分子谱常随着疾病的进展而发生变化。在癌症进展和治疗过程中，由于内源性及外源性的选择压力作用，肿瘤细胞的多个亚克隆种群相互竞争，促进优势子克隆体出现，而这些克隆体具有复制及转移能力强、治疗敏感性差等特点，最终导致肿瘤进展及耐药发生[1-3]。

在肿瘤精准治疗时代，有限的组织标本不能及时了解所有的肿瘤基因组变化，这可能错失治疗良机。而近年来引起极大关注的“液体活检”(Liquid biopsy，LB)可能会弥补这些不足。本文将针对结直肠癌领域的液体活检进行简要概括。

1 液体活检的生物学基础

液体活检技术主要通过无创手段提取血液、尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液甚至粪便等，而这些体液都已经被证实包含肿瘤来源的基因物质。现有研究证实[4-6]，液体活检能够测定癌症患者的基因谱、监测治疗反应、评估耐药性的发生、量化微小残留病灶。

1.1 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)

CTCs最早于1896年由澳大利亚的Thomas Ashworth在转移性肿瘤患者血液中发现，但是直到近15年才引起广泛关注。CTCs主要指肿瘤患者原发灶或者转移灶释放入外周血循环的肿瘤细胞，可以以单个细胞或者细胞簇形式存在[7]，通常CTCs浓度很低，在大多数肿瘤患者中，每10 mL外周血中能够分离出1～10个细胞[8]。目前分离CTCs的技术多种多样，例如，CTCs可以通过其大小及生物、物理性质进行阴性富集，或者通过这些细胞表面常表达的生物标志物，如上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)来进行阳性富集[9]。现有研究证实CTCs与肿瘤侵袭和转移有关，并且CTCs的数量与治疗效果及总生存期呈负相关[7]。即使在原发灶尚未出现症状之前，CTCs也极有可能在远处停留，并处于休眠状态，一段时间之后，休眠的细胞被重新激活，导致肿瘤转移，但其机制目前尚不清楚[10]。

1.2 循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)

ctDNA是坏死或凋亡的肿瘤细胞释放入外周血的DNA片段，主要来源于原发性肿瘤、CTCs、微转移灶及转移灶。ctDNA包含与其同源肿瘤细胞相同的基因缺陷，例如点突变、基因重组、扩增甚至基因拷贝数的变异等[11]。据统计，每天大约有3%的肿瘤DNA进入外周血循环中，而从肿瘤细胞中获得的ctDNA的比例差别较大(1.4%～47.9%)，这在很大程度上取决于肿瘤的大小和分期[12]。并且，一旦进入循环系统，ctDNA通过肝脏、肾脏等快速清除，半衰期从16分钟到数小时，虽然这带来检测上的挑战，但是能够反映肿瘤的实时变化状态[11]。

1.3 外泌体

外泌体是一类直径为40～100 nm的胞外盘状囊泡，可由血细胞、上皮细胞、免疫细胞、血小板及平滑肌细胞等通过内分泌及旁分泌的方式释放到多种体液中，进而影响临近细胞及远处区域的生物学行为及功能。其内容物包括蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA及LncRNA等，通过调节受体细胞活性，在细胞通信及物质运输方面发挥重要作用[13]。并且，肿瘤来源的外泌体可以调节宿主微环境，刺激新生血管形成、增强肿瘤侵袭能力，最终导致疾病进展及远处转移[14]。

1.4 基于肿瘤血小板的RNA测序

肿瘤血小板(Tumor-educated blood platelets，TEPs)是肿瘤相关生物学信息的另一种来源，作为全身及局部反应的中心分子，与肿瘤细胞相互作用，改变RNA表达谱，进而影响肿瘤的生长和扩散。Best等[15]研究者对不同类型的局部和转移性肿瘤患者及健康个体进行TEPs的RNA测序，结果提示其区分肿瘤的准确率达到96%，并且可以区分6种不同类型肿瘤，其判断原发肿瘤位置准确率达71%。因此，TEPs作为一种新兴的液体活检，可用于泛肿瘤分析、区分肿瘤类型以及肿瘤基因突变的诊断。

2 液体活检与结直肠癌的研究热点

2.1 在结直肠癌诊断中的作用

研究表明液体活检技术因其非侵入性、敏感性高等优势，结合不同的生物学标志物，可用于结直肠癌的早期诊断。目前，临床最普遍快捷的筛查结直肠癌的方式是便潜血试验及粪便免疫化学试验，虽然这两种非侵入性方法都有助于降低结直肠癌的死亡率，但是特异性及敏感性较低[16]。Bettegowda等[17]通过数字PCR技术(Digital PCR，dPCR)发现100%的转移性结直肠癌患者能够检测到ctDNA，而非转移性患者的检测率达73%。霍普金斯癌症中心通过新型的CancerSEEK方法，能对16个癌症基因突变及10种循环中的蛋白标记浓度进行评估。对1 005名已被诊断罹患8种常见类型癌症的I～III期患者以及812名健康对照者进行了研究；CancerSEEK检测到癌症的敏感性为69%～98%，特异性为99%。因此，CancerSEEK方法有利于癌症的早期发现，降低死亡率[18]。

多项试验证实外泌体包含的miRNA及蛋白组分的敏感性及特异性明显高于目前临床中应用的肿瘤标志物CEA、CA19-9。最近，Ogata等[19]分析对比了结直肠癌患者与健康人群血清中16种外泌体来源的miRNA，其中let-7a、miR-21、miR-23a、miR-150、miR-223、miR-1229、miR-1246含量在患者血清中显著升高，而手术切除后这些miRNA水平下调，并且miR-23a和miR-1246检测早期结直肠癌敏感性分别为95%、90%。采用高度敏感的ExoScreen分析技术，检测到结直肠癌细胞系外泌体表面存在膜蛋白CD147，并在患者血浆外泌体中得到相同结果，预示着CD147可能在未来成为早期诊断结直肠癌的指标[20]。

2.2 在结直肠癌预后中的作用

液体活检不仅能够早期诊断结直肠癌，而且可以评估疾病复发、预后及转移。在肿瘤转移的过程中，CTCs的存在可能是最早的亚临床阶段。一项对95例非转移性结直肠癌患者进行2年术后随访的研究显示，CTCs基线数量≥5的患者在根治性术后1年内发生远处转移的比率是CTCs<5的8倍，这意味着CTCs可以作为无病进展生存期及总生存期的独立预测因素[21]。另一项研究分析194名晚期肝转移患者的预后情况时发现，CTCs阳性与不可切除的肝转移瘤密切相关，这也提示CTCs能够影响肝转移瘤的治疗决策[22]。

Reinert等[23]开发了一项基于ctDNA的个性化检测方法，并通过dPCR技术评估量化了6位复发性结直肠癌及5位非复发性结直肠癌患者血浆的ctDNA及体细胞结构变异水平，研究结果证实ctDNA与传统的随访方法相比，可以提前10个月检测到肿瘤术后复发，其敏感性及特异性达100%。因此，对于根治性手术后的非转移患者而言，ctDNA能够在影像学及临床证实复发之前，捕捉和监测微小残留病灶，并通过基因组的改变早期预测肿瘤复发。

血清中外泌体来源的miR-19a及miR-17-92基因簇的表达水平与结直肠癌复发呈正相关，并且miR-19a的高水平表达也预示着疾病进展及预后不良[24]。而外泌体蛋白质组学揭示了整合素α6β4、α6β1与肺转移相关，αvβ5与肝转移有关，这也表明不同的整合素表达模式可以预测器官特异性转移[25]。另一项研究表明，外泌体来源的miR-200家族表达缺失，将导致肿瘤细胞更容易侵入血管及淋巴管，并且在5-氟尿嘧啶耐药的细胞系中同样观察到外泌体分泌的miR-200家族表达水平下降。这提示了外泌体miR-200家族的缺失，将导致肿瘤侵袭性增加，更易耐药[26]。

2.3 在结直肠癌治疗中的作用

在临床实践中，Ⅱ期结直肠癌化疗带来的绝对生存获益有限以及引起诸多不良反应，导致Ⅱ期结直肠癌是否需要化疗一直存在争议。一项关于Ⅱ期结肠癌术后患者的前瞻性研究指出，在未接受辅助化疗的178名患者中，14名在术后检测到ctDNA，其中11人(占79%)在27个月的随访中复发，而其余164名ctDNA阴性患者中，仅有16例复发(HR=18，95%CI：7.9～40)。另一组接受化疗的患者，化疗结束后ctDNA的存在同样降低了无复发生存率(HR=11，95%CI：1.8～68)。所以，在Ⅱ期结肠癌切除术后，ctDNA可以为微小残留病灶提供直接证据，同时识别发风险高的患者，有助于制定辅助治疗决策[27]。

在局部晚期直肠癌(Locally advanced rectal cancer，LARC)治疗领域，CTCs计数及参与免疫反应的调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)可以评估预测新辅助治疗的肿瘤客观反应情况。研究认为如果CTCs检测阳性则应建议患者接受更强的新辅助治疗方案(如诱导化疗)[28]。另外，直肠癌患者外周血中Treg含量明显高于健康人群，而新辅助放疗后存在不同程度的下降，并且与放疗剂量相关。初步数据显示，新辅助治疗5天后，Treg含量高的LARC患者肿瘤分期较好(

转移性结直肠癌患者需要检测RAS基因，来决定后续的治疗方案，而以往的研究出现血液中与组织中检测基因突变情况存在不一致性，即组织检测为KRAS野生型而外周血中检测为突变型。体内和体外试验的ctDNA分析表明，阻断EGFR通路，KRAS和NRAS突变将快速出现，通常在影像学证实肿瘤复发之前，就能够检测到突变的发生。而观察应用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗转移性结直肠癌患者ctDNA发现，阻断EGFR通路，将导致KRAS突变克隆的产生，而停药后克隆逐渐减少，一段时间后，肿瘤细胞能够再次恢复药物敏感性，这表明克隆进化持续存在，而ctDNA能够动态监测KRAS突变水平，为重新应用抗EGFR类药物提供依据[1]。另外，KRAS野生型及突变型的细胞系外泌体miRNA表达谱不同，miR-10b在野生型中选择性上调，而miR-100在突变型中上调，这也提示外泌体miRNA作用于受体细胞，未来可能会成为预测KRAS突变的新模式，指导患者的治疗方向[30]。

3 小结与展望

随着精准医疗时代的来临，液体活检作为近年来新兴起的分子诊断技术，在临床诊疗工作中发挥着越来越重要的作用，为临床实践带来机遇。它的优势在于可以动态监测克隆进化、肿瘤负荷、指导靶向治疗，在肿瘤个体化治疗方面具有实用性。但是，目前液体活检处于研究阶段，仍然面临很多挑战，尚需要规范化技术及大规模前瞻性临床试验来证明。相信在不远的未来，液体活检可以更加精确全面的提供肿瘤基因组学信息，为患者带来希望的曙光。