PD-1、CTLA-4、BLTA在食管鳞状细胞癌患者外周血中的表达及临床意义

郝 贺 李 幸 吴玲彦 郭晓金 曹 静 杨春旺 张 晓 汪治宇

近年来，随着肿瘤免疫学的发展，人们逐渐认识到肿瘤生长过程中会产生免疫抑制环境，促进肿瘤细胞逃逸。其中，抑制性协同刺激因子受体在肿瘤免疫逃逸中发挥着重要作用[1-3]。程序性死亡分子1(Programmed cell death 1，PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)、B和T淋巴细胞衰减蛋白(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是目前研究较热的抑制性协同刺激因子受体，其与相应配体结合后产生的负性信号可抑制T淋巴细胞的激活、增殖及细胞因子分泌，减弱宿主的抗肿瘤免疫反应[4-6]。目前，抗PD-1、CTLA-4单药或联合用药已经获批用于临床治疗黑色素瘤、肾癌及非小细胞肺癌等肿瘤，并获得明显的疗效[7]，针对阻断BTLA靶点的研究正在进行[8]。鉴于肿瘤微环境的复杂性及PD-1、CTLA-4、BTLA作用机制的不同，在同一个体中，PD-1、CTLA-4、BTLA表达情况如何，三者之间是否具有一定相关性，我们不得而知。本研究以食管鳞状细胞癌患者及健康人作为研究对象，通过检测和对比患者及健康人外周血中可溶性PD-1(Soluble PD-1，sPD-1)、可溶性CTLA-4(Soluble CTLA-4，sCTLA-4)及可溶性BTLA(Soluble BTLA，sBTLA)表达水平，并结合临床病理特征及手术干预对其表达的影响，探讨其与食管鳞状细胞癌发生发展的关系，并分析三者之间的相关性及作为生物标记物的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016年6月—2017年4月河北医科大学第四医院胸外科收治的食管鳞状细胞癌患者90例。其中男59例，女31例；年龄43～90岁，中位年龄65岁。纳入标准：所有患者均经病理检查确诊为食管鳞状细胞癌，未进行过手术、化疗、放疗或其他生物治疗，且无全身免疫系统疾病。90名患者中行手术治疗50例，其中男37例，女13例；年龄43～76岁，中位年龄63岁。术后TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期15例，Ⅲ期21例。对照组为同期本院体检中心性别和年龄相匹配的健康体检者40例，其中男25例，女15例；年龄54～76岁，中位年龄62岁。本研究中所有研究对象均知情同意并上报医院伦理委员会批准。

1.2 试剂及仪器

人sPD-1、sCTLA-4及sBLTA ELISA检测试剂盒均购自北京易科拜德科技有限公司；酶标仪(仪器型号：DNM-9602)购自北京普朗新技术有限公司；洗板机(仪器型号：AC8)购自芬兰Thermo Labsystems公司；TG16W微量高速离心机购自长沙湘智离心机有限公司；GNP-9080型隔水式恒培养箱购自台湾斯特仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本的收集及处理 所有研究对象均为清晨空腹采血，行手术患者均为术后第5天再次采血。用普通促凝真空采血管采静脉血(外周血)5 mL，静置30 min，3000×g离心10 min后取上清液，-80℃冻存备用。

1.3.2 血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA的检测 采用ELISA法检测血清sPD-1、sCTLA-4及sBLTA的含量，操作步骤参照试剂盒说明书进行。将sPD-1、sCTLA-4及sBLTA标准品依次稀释，在96孔板中分别加入50 μL血清样本或标准品，温育30 min，清洗液洗2次，然后加入酶标试剂50 μL，温育30 min，每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，每孔加终止液50 μL反应结束。酶标仪读取450 nm吸光度(OD)值，根据标准品吸光度绘制标准曲线，然后计算血清sPD-1、sCTLA-4及sBLTA的表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件对各组数据进行统计学分析，两组间比较使用两独立样本t检验或配对t检验，多组间的比较使用方差分析或秩和检验，相关性分析采用Spearman秩相关分析，影响因素分析使用多因素线性回归分析，P<0.05为差异有统计学。

2 结果

2.1 食管鳞癌组与正常人组血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表达水平

食管鳞癌组血清sPD-1、sCTLA-4及sBLTA水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2 食管鳞癌组手术前后血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表达水平

食管鳞癌组血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA手术前后水平差异无统计学意义(P>0.05)，说明手术干预对sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表达无影响(表2)。

表1 食管鳞癌组与正常人组血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表达水平Table 1 The serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA between ESCC and healthy control groups(pg·mL-1)

表2 食管鳞癌组手术前后患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表达水平Table 2 Serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA in patients between before and after surgery(pg·mL-1)

2.3 食管鳞癌患者血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表达水平与患者临床病理特征相关性

sPD-1和sBLTA的表达水平与临床病理特征无显著关系，sCTLA-4的表达水平与TNM分期关系显著(P<0.05)，与T分期、N分期、肿瘤体积大小、肿瘤部位、组织分化程度、性别、年龄无显著性关系，提示相对于sPD-1和sBLTA，sCTLA-4在食管鳞癌分期变化中更为敏感，可能作为预测食管鳞状细胞癌病情严重程度的生物学指标(表3)。

表3 不同特征的食管鳞癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表达水平的比较Table 3 Correlation between the serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA and clinicopathological parameters

2.4 食管鳞癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表达水平的影响因素分析

分别以sPD-1、sCTLA-4和sBLTA作为因变量，以年龄、性别、T分期、N分期、TNM分期、肿瘤体积大小、肿瘤部位、组织分化程度作为自变量纳入到多元线性回归模型中，多元线性回归模型分析结果显示，性别、年龄、T分期、N分期、TNM分期肿瘤体积大小、肿瘤部位、组织分化程度均不是sPD-1、sCTLA-4和sBLTA表达水平的影响因素(P>0.05)(表4)。

表4 食管鳞癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表达水平的影响因素分析Table 4 Correlation between the serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA and clinicopathological parameters

2.5 食管鳞癌患者血清中sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表达水平的相关性分析

将90例食管鳞状细胞癌患者外周血sPD-1、sCTLA-4及sBLTA所测得数据行正态性分析，其数据呈现非正态分布，故行Spearman相关性分析，结果显示，sPD-1、sCTLA-4及sBLTA两两之间无相关性，间接说明了三者通过不同的信号通路调控免疫应答(表5)。

表5 食管鳞癌患者血清中sPD-1，sCTLA-4及sBLTA表达水平的相关性Table 5 Correlation among the serum levels of sPD-1，sCTLA-4 and sBLTA

3 讨论

T细胞的活化需要双信号途径，第一信号途径为抗原递呈细胞上的主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)-抗原肽复合物与T细胞上的TCR结合，第二信号为抗原递呈细胞上的共刺激分子B7与T细胞上的CD28分子结合。在这两种信号共同作用下，T细胞活化、增殖，具备杀伤肿瘤细胞的能力。在第二信号通路中，存在激活性协同刺激因子受体及抑制性协同刺激因子受体，后者在负性调控T细胞应答方面发挥重要作用[9-10]。PD-1、CTLA-4、BLTA是近年来研究较热的负性共刺激信号分子。针对PD-1、CTLA-4靶点研发的单抗类药物，如Nivolumab、Pembrolizumab、Pidiluzumab和Ipilimumab已经在黑色素瘤、肾癌及非小细胞肺癌患者临床治疗中得以应用，患者的生存期得以延长。

然而，作为我国最常见的恶性肿瘤之一的食管癌，目前标准疗法仍然限于手术或内镜切除及放化疗，且总体预后较差。故有必要进一步了解食管癌的分子发病机制，探索新的生物标志物进行靶向治疗。目前为止，有关抑制性协同刺激因子受体在食管癌的报道开始涌现。我国学者张锋[11]指出食管鳞癌组织中PD-1在癌组织、癌旁组织、远癌组织中的阳性表达率分别为56.9%、22.2%、3.0%，且PD-1阳性表达率与食管癌患者肿瘤大小、淋巴结转移有关，与年龄、性别、浸润深度、临床分期、病理分级无关，然而Kim等[12]的研究表明食管鳞癌组织中PD-1的表达与临床病理特征及其预后无相关性。笔者推测可能是组织中PD-1表达的异质性、PD-1阳性的定义及诊断所用抗体不同等因素造成。Zhang等[13]通过检测食管鳞状细胞癌手术标本中肿瘤细胞及浸润性淋巴细胞中CTLA-4的表达，发现87%的肿瘤细胞表达CTLA-4，在浸润性淋巴细胞中，58%的样本为CTLA-4阳性，且双阳性表达者与较差的总生存期相关。目前研究表明，这些共抑制因子受体除了在细胞膜上表达(膜型)外，还可以以可溶性形式存在于血清中，即可溶性抑制性协同刺激因子受体[14-16]。已有文章指出可溶性sPD-1、sCTLA-4及sBLTA能够像细胞膜表面的分子一样与受体相互作用发挥一定的生物学功能[17-19]。因此，本研究试图探索可溶性协同刺激因子受体sPD-1、sCTLA-4及sBLTA在食管鳞状细胞癌的表达及临床意义，为食管鳞癌的免疫靶向药物的研发提供理论依据。

本研究结果显示，食管鳞癌组血清中sPD-1及sCTLA-4水平均高于正常人组，差异有统计学意义。BLTA作为一个新的免疫阻断位点，本研究首次证实其在正常人组与食管鳞癌组表现出明显的差异。针对手术患者，本研究发现肿瘤病灶经手术切除后，sPD-1、sCTLA-4及sBLTA未出现明显改变，推测这可能与检测间隔较短(术后第5天)有关，甘涛等[20]通过检测直肠癌根治术后第3天、第7天外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及NK细胞活性，发现手术可抑制患者的免疫系统，术后应激可造成外周血淋巴细胞总数下降，术后第7天较术后第3天以上指标均有不同程度的回升。本研究中，sPD-1、sCTLA-4及sBLTA为抑制性协同刺激因子，在术后第5天机体可能依然处于应激状态，故其表达未发生明显改变，若延长监测时间，结果可能会有所改变。在分析sPD-1、sCTLA-4及sBLTA水平与食管鳞癌病理特征相关性时，只有单因素分析中sCTLA-4表达与食管鳞癌患者的TNM分期有关，而与其它病理特征无相关性，提示相对于sPD-1和sBLTA，sCTLA-4在食管鳞癌分期变化中更为敏感，可能作为预测食管鳞状细胞癌病情严重程度的生物学指标。本研究发现sPD-1、sCTLA-4及sBLTA表达两两之间无相关性，间接说明了三者通过不同的信号通路调控免疫应答，同时为联合应用免疫位点阻断药物提供了一定的理论依据。

综上所述，抑制性协同刺激因子受体在肿瘤免疫逃逸及免疫耐受过程中发挥重要作用。PD-1及CTLA-4抑制剂在黑色素瘤、肾癌及非小细胞肺癌等实体肿瘤中获得了一定成功，但由于肿瘤免疫微环境的复杂性，免疫治疗也存在无效或促进肿瘤生长等情况[21-23]。目前尚未找到确切的疗效预测指标，筛选出最佳获益群体。外周血检测具有实时、无创、动态监测等特点，相信随着对肿瘤微环境研究的深入，检测技术的提高，外周血检测可替代组织标本或两者有机结合，找到理想的预测指标，使免疫位点阻断剂的应用更具有针对性，效果会更加确切，最终使广大肿瘤患者受益。