响应面法优化蒙药肋柱花总皂苷超声提取工艺

李红娇，刘 婷，孙兴姣，樊 培，李 骁

（内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110）

肋柱花（蒙药名哈毕日干－地格达）生长于海拔4 200 m以下的山坡、草地及水沟边，为龙胆科植物肋柱花 Lomatogonium rotatum（L.） Fries ex Nym 的干燥全草，分布于西南、西北、华北、东北等地区[1]，主治肝胆热、黄疸、伤寒、流感、中暑头痛、瘟疫等病症[2－3]。其常作为主药与胡黄连、栀子、瞿麦配伍为地格达－4味汤散，用于治疗血热证，又可与查干泵嘎、木鳖子（制）、木香等配伍为八味地格达汤，用于治疗协日性头痛、中暑、身目发黄、肝热证[4]。研究发现，肋柱花中含有黄酮类及其苷类、环烯醚萜类、三萜类及其苷类、内酯类、有机酸及酚类化合物[5－7]。其中三萜类及其苷类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、免疫调节等活性[8－9]。目前，超声波辅助提取法已得到广泛应用，尤其是在提取工艺优化方面已逐渐成为一种新方法。为此，本试验中选取乙醇体积分数、液料比、超声时间3个因素，通过响应曲面法优选蒙药肋柱花总皂苷提取工艺，从而为该蒙药的进一步研究提供简单、快速的方法。现报道如下。

1 仪器及试药

1.1 仪器

TU－1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；OSB－2100－CE型旋转蒸发器（东京理化器械株式会社，埃朗科技国际贸易有限公司）；HH－S2型数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；KH5200DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；DS－Y350型高速多功能粉碎机（上海市顶帅工贸有限公司）。

1.2 试药

蒙药肋柱花，2015年购自内蒙古锡林郭勒盟西乌旗，经内蒙古医科大学李骁副教授鉴定为龙胆科植物肋柱花 Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym的干燥全草；齐墩果酸（批号为150305，上海如吉生物科技公司）；香草醛、冰醋酸、高氯酸和无水乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定

2.1.1 溶液制备

对照品溶液：称取齐墩果酸对照品2.02 mg，精密称定，用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶，混匀，得终质量浓度为0.202 g／L的齐墩果酸对照品溶液。

供试品溶液：称取干燥的肋柱花粉末0.5 g，精密称定，过5号筛[10]，用适量体积分数的乙醇超声波提取一定时间，过滤，浓缩滤液，用对应体积分数的乙醇超声溶解后定容于10 mL容量瓶中，摇匀，即得。

2.1.2 测定波长选择

精密吸取供试品溶液或齐墩果酸对照品溶液适量，置10 mL容量瓶中，将溶剂挥干后加入新配制的5%香草醛 －冰醋酸溶液 0.2 mL 和高氯酸溶液 0.8 mL[11－13]，摇匀，于60℃恒温水浴15 min，迅速冷却10 min，加冰醋酸至刻度，摇匀，在可见光（400～800 nm波长）范围内进行扫描。根据扫描图谱，最终选取在最大吸收波长（546 nm）处测定吸光度（见图 1）。

图1 齐墩果酸紫外吸收光谱图

2.1.3 方法学考察

标准曲线绘制[14]：分别精密吸取齐墩果酸对照品溶液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，按2.1.2项下方法进样测定在546 nm波长处的吸光度，以吸光度值（Y）为纵坐标、齐墩果酸质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y＝44.475 X－0.007 1， R2＝0.999 6（n＝7）。结 果 表明，齐墩果酸质量浓度在 2.02 ～ 20.2 μg／mL 范围内与吸光度线性关系良好。标准曲线见图2。

图2 齐墩果酸标准曲线

精密度试验：精密量取同一供试品溶液0.1 mL，按

2.1.2 项下测定方法于同一波长下连续测定吸光度6次。结果的 RSD为1.33%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液 0.1 mL，按 2.1.2 项下显色方法，于室温分别放置 0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60 min，在 546 nm 波长处测定吸光度。结果供试品溶液在20 min内的总皂苷含量分别为26.4，26.0，25.68，25.41，25.19 mg ／g，RSD 为 1.86%(n ＝5)，表明方法稳定性良好。

重复性试验：精密称取同一批样品6份，依法制备供试品溶液并显色，在同一波长（546 nm）下测定吸光度。结果供试品溶液中总皂苷含量的平均值为27.30 mg／g，RSD为1.67%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.1.4 含量测定方法

精密吸取供试品溶液0.1 mL，置10 mL容量瓶中，按2.1.2项下显色方法，将溶剂挥干后于546 nm波长处测定吸光度。根据标准曲线读出供试品溶液中所含齐墩果酸的质量，从而计算出总皂苷的含量。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数

称取肋柱花粉末0.5 g，精密称定，维持液料比和提取时间不变，在不同乙醇体积分数（50% ～90%）下测定总皂苷含量，每个平行因素作3组。结果见图3。可见，乙醇体积分数为80%时总皂苷提取量最高，故选择70%，80%，90%乙醇进行优化。

图3 乙醇体积分数对总皂苷含量的影响

2.2.2 液料比

称取肋柱花粉末0.5 g，精密称定，维持乙醇体积分数和提取时间不变，在不同液料比（10～50 mL／g）下测定总皂苷含量，每个平行因素作3组。结果见图4。可见，液料比为30 mL／g时总皂苷提取量最高，故选择20，30，40 mL ／g的液料比进行优化。

2.2.3 超声时间

称取肋柱花粉末0.5 g，精密称定，维持乙醇体积分数和液料比不变，在不同超声时间（20～60 min）下测定总皂苷的含量，每个平行因素作3组。结果见图5。可见，超声时间为30 min时总皂苷提取量最大，故选择超声时间在20，30，40 min时进行优化。

图4 液料比对总皂苷含量的影响

图5 超声时间对总皂苷含量的影响

2.3 响应面法优化试验

2.3.1 因素水平选择

根据前期的单因素试验，选取乙醇体积分数（因素A，% ），液料比（因素 B，mL ／g），超声时间（因素 C，min）为自变量，以肋柱花总皂苷含量为响应值，设计3个因素3个水平对肋柱花超声提取工艺进行优化。响应面试验设计及结果见表1和表2。

表1 响应面试验设计因素水平表

2.3.2 模型建立及显著性分析[15]

采用 Design－Expert 8.0.6.1 响应面分析软件对17组试验数据（表2）进行分析，得二元回归方程：

由表 3可见，F模型＝8.65，P ＝0.004 8＜0.01，差异有统计学意义；P失拟＝0.512 4＞0.1，差异无统计学意义。在总的作用因素中，一次项，液料比差异极显著，乙醇体积分数、超声时间差异不显著，由表3中 F值可知，影响总皂苷提取量的因素大小依次为B＞A＞C；交互项除AB（乙醇体积分数和液料比因素的交互作用）差异极显著外，其余均无显著影响；二次项，只有 A2（乙醇体积分数和乙醇体积分数交互作用）差异极显著，其余均不显著。

表2 响应面试验结果

表3 响应面方差分析结果

2.3.3 各因素间交互效应分析[16]

图6至图8为拟合模型绘制的蒙药肋柱花总皂苷的等高线及响应面图。分析可见：1）乙醇体积分数固定不变时，液料比增加，总皂苷含量也随之增加；液料比固定，乙醇体积分数增加，总皂苷含量先增加后减少；乙醇体积分数在75% ～85%时，总皂苷含量基本不变。2）乙醇体积分数不变时，超声时间增加，总皂苷含量先上升后下降；当超声时间不变时，乙醇体积分数增加，总皂苷含量也随之上升，到达一定程度后，乙醇体积分数增加而总皂苷含量反而下降。当乙醇体积分数在75%～85%时，总皂苷含量最高且趋于稳定。3）液料比不变时，随着超声时间的增加，总皂苷含量减少；而超声时间不变时，总皂苷含量随着液料比的增加而上升。

图6 乙醇体积分数和液料比的等高线及响应面图

图7 乙醇浓度和超声时间的等高线及响应面图

图8 液料比和超声时间的等高线及响应面图

2.3.4 提取工艺优化

经分析软件预测得到的提取参数条件为乙醇体积分数 77.1% ，液料比 40 mL ／g，超声时间 32.95 min。实际操作条件修正为乙醇体积分数77%，液料比40 mL／g，超声时间33 min。

2.4 验证试验

在优化提取工艺条件下，精密称取3份药材样品，按2.1.2项下方法对预测结果进行验证试验。结果供试品溶液的总皂苷含量分别为 27.03，27.48，27.57 mg／g，平均 27.36 mg／g，结果的 RSD 为 1.06% （n ＝ 3）。实测值与理论预测值(27.50 mg／g)非常接近。可见，对于多目标优化肋柱花总皂苷提取工艺，响应面法具有可靠性和实际应用价值。

3 讨论

本试验中选取了3个因素（乙醇体积分数、液料比、超声时间）作为考察肋柱花总皂苷含量影响的因素，通过单因素试验采用 Design－Expert 8.0.6.1软件设计出17组响应面优化试验，再根据结果进行分析，最终得到各个因素水平的相互作用，并作出形象又直观的等高线图及响应面图。进而可初步筛选出各影响因素的最佳取值范围[17]。

肋柱花为蒙医常用药，已作为主药与其他药材配伍用于各种疾病中。目前，对肋柱花化学成分研究相对较多的是黄酮类化合物，而对皂苷类成分研究较少见。因此，本试验中旨在通过紫外分光光度法对肋柱花总皂苷提取方法作进一步优化，为对肋柱花化学成分更深入的研究提供基础依据。

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