何首乌中THSG和蒽醌类成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用

张照研+杨亮+黄小燕+汪美汐+马增春+汤响林+王宇光+高月

[摘要] 该文探讨何首乌主要化学成分2，3，5，4′-四羟基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside，THSG）、蒽醌类（大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚）对人孕烷X受体（human pregnant X receptor，PXR）介导的CYP3A4的转录调控作用。利用前期建立的PXR介导的CYP3A4药物诱导快速筛选技术，采用MTS细胞检测方法考察何首乌中主要化学成分对细胞活性的影响，计算IC50；利用双荧光素酶报告基因系统，将PXR表达载体和含CYP3A4转录调控区的报告基因载体共转染HepG2细胞，10 μmol·L-1利福平（RIF）为阳性对照，10 μmol·L–1酮康唑（TKZ）为阴性对照，用THSG（2.5，5，10 μmol·L-1）和蒽醌类成分（2.5，5，10 μmol·L-1）分别处理24 h，进行双荧光素酶活性检测。结果表明，空载质粒pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，THSG、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素对CYP3A4的调控多为抑制效应，大黄素对CYP3A4产生诱导作用；pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4共转染时，THSG、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素均产生诱导效应。综上，THSG和蒽醌类成分均可对CYP3A4产生抑制或激活效应，PXR参与后，上述成分对CYP3A4均产生诱导效应，提示何首乌中主要成分对CYP3A4的诱导作用是通过PXR实现的。以上结果提示在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用，提高中药的安全性和有效性。

[关键词] 何首乌； THSG； 蒽醌类成分； 人孕烷X受体； 细胞色素P450 3A4

[Abstract] The rapid screening technology was used to investigate the transcriptional regulation effect of main chemical constituents in tubers of Polygonum multiflorum， including 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside（THSG） and anthraquinones （such as rhein， chrysophanol， aloe-emodin， emodin） on CYP3A4 drug inducers induced by human pregnancy X receptor （PXR）.The effect of chemical composition on the cell activity was detected by MTS cell viability assay. IC50 was calculated. The expression vector and the reporter vector were co-transfected into HepG2 cells， with 10 μmol·L-1 rifampicin （RIF） as a positive control， and 10 μmol·L-1 ketoconazole （TKZ） as a negative control. After treated with different concentrations of anthraquinones （2.5， 5， 10 μmol·L-1） for 24 h， the cells were tested for dual luciferase activity. The results show that the inhibitory effect of THSG， chrysophanol， emodin， rhein and aloe-emodin on CYP3A4 was inhibited by co-transfection of pcDNA3.1 and pGL4.17-CYP3A4. The expressions of pcDNA3.14-PXR and pGL4.17-CYP3A4 were induced by the four compounds. Besides， emodin had a direct inducing effect. In conclusion， the four anthraquinone compounds have an inducing effect on CYP3A4 by PXR， but emodin can directly induce CYP3A4. THSG can inhibit CYP3A4， but plasmid can induce CYP3A4 after intervened with PXR.These results suggest that we should pay attention to the liver function and avoid liver damage in the combined administration of drugs.

[Key words] Polygonum multiflorum； THSG； anthraquinones； human progesterone X receptor （PXR）； CYP3A4

中藥何首乌是蓼科蓼族何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的块根。生何首乌可安神、养血、活络、解毒（截疟）、消痈；制何首乌具有补益精血、乌须发、强筋骨、补肝肾之功效。何首乌的主要化学成分有二苯乙烯苷类、蒽醌类、鞣质类、聚合花青素类、卵磷脂类等[1]。药理学研究显示，何首乌在治疗肝病方面应用广泛，在治疗非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝纤维化、乙肝、肝癌等方面具有较好效果。endprint

随着中草药广泛应用和不良反应监测体系不断完善，中草药相关性肝损伤（herb-induce liver injury，HILI）报道呈升高趋势[2]。中草药相关性肝损伤在药物导致肝损伤（drug-induce liver injury，DILI）中占一定比例，原因具有复杂性。研究表明，何首乌可用于肝脏疾病的治疗，对特定人群却能导致肝脏的损伤[3]。近些年来，何首乌及其制剂和保健品导致肝损伤的报道呈上升趋势[4-5]。2013年10月，CFDA发布5种含何首乌药物对特定人群禁用的通告。2014年7月，药品不良反应信息（第61期）通报口服何首乌及其成方制剂可能有引起肝损伤的风险。2014年7月和9月，CFDA发布何首乌保健食品监管和含何首乌保健食品成分变更的通知。临床上报道中草药肝损害的案例中，何首乌的病例为第1位，为药物性肝损伤的第15位[6]。因此研究何首乌致肝损伤作用机制对于指导何首乌临床合理使用尤为重要。本文主要观察何首乌中主要化学成分二苯乙烯苷类的2，3，5，4′-四羟基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside，THSG）和蒽醌类成分对药物代谢酶CYP3A4的影响，探究CYP3A4的主要调控因子孕烷X受体是否参与何首乌主要化学成分对CYP3A4的转录调控作用，以期为何首乌致肝毒性作用机制提供实验依据，为临床指导使用何首乌及其联合用药提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 3110细胞培养箱（Thermo公司）；Microfuge 22R台式高速离心机（Beckman公司）；Axiovert 40倒置显微镜（ZEISS公司）；VICTOR X多标记酶标仪 （Perkin Elmer公司）。

1.2 药物与试剂 THSG（CAS：82373-94-2，Lot：F210036），大黄酸（CAS： 478-43-3，Lot：F522425），大黄酚（CAS： 481-74-3，Lot：F249787），大黄素甲醚（CAS：521-61-29，Lot：F465584），芦荟大黄素（CAS： 481-72-1，Lot：F060344），均购买于上海一飞生物科技有限公司，纯度均大于98%，见图1；利福平（CAS：13292-46-1，Cat No.：S1764，Lot.01），酮康唑（CAS：65277-42-1，Batch No.：14239）购于Selleck公司，以上成分均用DMSO溶解制备10 mmol·L-1母液，-20 ℃保存备用。DMEM培养基（美国Gibco公司，Lot：1621440），Gibco胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific公司，Lot：505985），胰蛋白酶（Sigma公司，批号E23AT050），青霉素链霉素双抗溶液（HyClone公司，Lot：J170012），MTS（Promega公司，Lot：0000171446）。lipofectamine 2000（ThermoFisher公司，Lot：1815568）。

1.3 细胞和质粒 HepG2细胞均购于中国医学科学院基础医学研究所，由本实验室冻存保种。完全培养基由10%FBS，100 mg·L-1青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基构成。细胞在37 ℃，5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。质粒pGL-4.17-CYP3A4，pcDNA3.14-PXR由实验室构建并保存，空载质粒pcDNA3.14-vector、内参质粒pLR-TK购于美 国Promega公司。

1.4 MTS法检测细胞存活率 对数期的HepG2细胞经胰酶消化，接种于96孔板，待细胞密度达到80%时，吸弃培养液，用磷酸缓冲液（PBS）洗涤1次，换成分别含有不同浓度药物成分的含2%血清但不含双抗的DMEM培养基，培养24 h；吸弃含药培养基，每孔加入20 μL MTT，孵育1 h，在595 nm处用酶标仪测定吸光度。每组设3副孔，细胞的活性按以下公式计算：细胞活性=[（用药组-空白组）/（对照组-空白组）]×100%，用GraphPad Prism计算半数抑制浓度（IC50）。

1.5 药物处理和荧光素酶活性检测 按照转染试剂 lipofectamine 2000说明书操作，取对数生长期 HepG2细胞，胰酶消化，细胞计数，按照每孔2.5×105细胞接种于24孔板中，当细胞密度达到约80%时，用Opti-MEM培养液稀释质粒。500 ng pcDNA3.1-hPXR，250 ng pGL4.17-CYP3A4以及50 ng pRL-TK内参质粒，2 μL lipofectamine 2000混匀，室温孵育20 min，每孔加入100 μL混合转染液，放细胞培养箱中培养。转染6 h，吸去混合液，加入含有不同濃度药物的含2%血清不含双抗的DMEM培养基，设置10 μmol·L-1利福平（RIF）给药孔作为阳性对照组，10 μmol·L-1酮康唑（TKZ）给药孔作为阴性对照组，每组分别设3个副孔。放入37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中培养24 h，吸去各组培养液，用PBS洗涤细胞1次，每孔中加入100 μL 1×PLB溶液，室温下静止裂解15 min后，加入100 μL LABⅡ溶液，用多功能酶标仪检测各孔的萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）活性；紧接着各孔加入100 μL Stop&Glo试剂，启动海肾萤光素酶反应后，对海肾荧光素（renilla luciferase）荧光活性进行检测，并计算荧光值比值。

1.6 统计学分析 实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，多组数据间比较采用方差分析，两两比较采用t检验处理，P<0.05表示有统计学意义。endprint

2 结果

2.1 THSG和蒽醌类成分对细胞存活率的影响 THSG在较高浓度下对细胞增殖有抑制作用，见图2A，经计算THSG的IC50为366.9 μmol·L-1。

2.2 大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对细胞存活率的影响 蒽醌类成分对细胞存活率的影响见图2B～图2F。各成分给药浓度分别为2.5，5，10 μmol·L-1时，经GraphPad Prism计算，大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素的IC50分别为9.46，19.29，13.95，26.06，13.65 μmol·L-1。

2.3 THSG对PXR介导的CYP3A4的转录调节作用 结果见图3A。与对照组比较，RIF组CYP3A4荧光素酶活性显著增强（P<0.001），表明hPXR-CYP3A4荧光素酶报告基因体系响应正常。空载体pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，THSG给药组对CYP3A4的表达分别是对照组的（0.63±0.08）倍（P<0.01），（0.52±0.09）倍（P<0.01），（0.69±0.14）倍（P<0.001），均具有显著性抑制作用；当pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4共转染时，THSG明显增加CYP3A4活性的表达，和空载质粒pcDNA3.1与CYP3A4质粒共转染相比较，均有显著性统计学差异（P<0.01），表明PXR参与THSG对CYP3A4的表达调控。

2.4 蒽醌类成分对PXR介导的CYP3A4的转录调节作用 大黄素：结果见图3B。空载体pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，大黄素给药组对CYP3A4的诱导表达分别是对照组的（1.42±0.23）倍（P<0.05），（1.75±0.10）倍（P<0.001），（2.51±0.11）倍（P<0.001），具有显著性诱导作用；当pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4共转染时，大黄素对CYP3A4的表达活性显著增强，和空载质粒pcDNA3.1与CYP3A4质粒共转染相比较，仅有10 μmol·L-1的大黄素给药组对CYP3A4的诱导倍数具有统计学差异（P<0.05）。研究结果提示大黄素对CYP3A4具有直接诱导作用，体外转染的PXR一定程度上增强大黄素对CYP3A4的诱导作用。

大黄酚：结果见图3C。空载体pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，大黄酚给药组CYP3A4的活性分别是对照组的（0.92±0.01）倍（P<0.05），（0.78±0.04）倍（P<0.01），（0.70±0.03）倍（P<0.001），具有显著性抑制作用；当pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4 共转染时，给药组CYP3A4的活性分别是对照组的（1.03±0.02）倍，（1.10±0.04）倍（P<0.05），（1.10±0.03）倍，结果显示，2.5，10 μmol·L-1给药组有微弱诱导作用，无统计学意义。大黄酚对CYP3A4有微弱诱导作用。

大黄酸：结果见图3D。空载体pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，大黄酸给药组CYP3A4的活性分别是对照组的（0.71±0.02）倍（P<0.001），（0.62±0.04）倍（P<0.001），（0.76±0.01）倍（P<0.01），具有显著性抑制作用；当pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4 共转染时，给药组CYP3A4的活性分别是对照组的（1.56±0.07）倍（P<0.001），（1.47±0.12）倍（P<0.001），（1.29±0.06）倍（P<0.001）。pcDNA3.14-PXR质粒与CYP3A4质粒共转染时CYP3A4的荧光倍数分别为空载质粒pcDNA3.1与CYP3A4质粒共转染时的（2.22±0.18）倍（P<0.01），（2.22±0.17）倍（P<0.01），（1.70±0.08）倍（P<0.01）。以上结果表明，大黄酸能通过调控因子PXR诱导CYP3A4的表达。

大黄素甲醚：结果见图3E。空载体pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，大黄素甲醚给药组CYP3A4的活性分别是对照组的（0.63±0.08）倍（P<0.01），（0.52±0.09）倍（P<0.01），（0.68±0.01）倍（P<0.001），具有显著性抑制作用；当pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4共转染时，给药组CYP3A4的活性分别是对照组的（1.21±0.04）倍（P<0.001），（1.21±0.06）倍（P<0.001），（1.05±0.04）倍（P<0.01）。pcDNA3.14-PXR质粒与CYP3A4质粒共转染时CYP3A4的荧光倍数分别为空载质粒pcDNA3.1与CYP3A4质粒共转染时的（1.71±0.21）倍（P<0.01），（2.09±0.21）倍（P<0.01），（1.54±0.03）倍（P<0.01）。以上结果表明，大黄素甲醚能通过PXR诱导CYP3A4的表达。

芦荟大黄素：结果见图3F。空载体pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，芦荟大黄素给药组CYP3A4的活性分别是對照组的（0.60±0.04）倍（P<0.001），（0.68±0.04）倍（P<0.001），（1.27±0.08）倍（P<0.01），3个给药组中，2.5，5 μmol·L-1具有显著性抑制作用，10 μmol·L-1给药组有显著诱导作用；当pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4共转染时，给药组CYP3A4基因的表达分别是对照组的（1.40±0.05）倍（P<0.001），（1.19±0.11）倍，（1.56±0.14）倍（P<0.01）。pcDNA3.14-PXR质粒与CYP3A4质粒共转染时CYP3A4的诱导活性分别为空载质粒pcDNA3.1与CYP3A4质粒共转染时的（2.35±0.22）倍（P<0.01），（1.65±0.24）倍（P<0.05），（1.72±0.03）倍。以上结果表明，芦荟大黄素2.5，5 μmol·L-1给药浓度下能通过PXR诱导CYP3A4的表达，10 μmol·L-1给药组能直接产生直接诱导效应。endprint

3 讨论

中药致肝损伤与其在肝脏代谢过程密切相关[7]。中药作为外源性物质，其主要化学成分在肝脏以细胞色素P450为核心的单加氧酶系的作用下，进行氧化、还原等一系列反应，最终转化为极性化合物排出体外。长期服用中药可能对肝脏的药物代谢酶产生影响，进而影响其他药物的代谢，药物相互作用能使毒性增强和不良反应产生。CYP3A4是细胞色素 P450超家族的主要成员，负责代谢50%以上的临床药物，对药物的吸收、代谢、排泄有重要的作用[8-9]。PXR作为调控因子，在CYP3A4的表达中起到主要调控作用[10-13]。许多药物能活化PXR，间接影响CYP3A4的表达[14-16]。基于前期建立的药物代谢酶体外筛选平台，通过对中药成分的筛选分析，实验室得到一批具有潜在CYP450诱导和抑制能力的化合物，并对产生诱导或抑制作用机制进行探讨，这些研究对于阐明中药复方组分配伍减毒增效的特点和规律具有十分重要的价值[14，17]。研究药物对PXR介导的CYP3A4的转录调节作用有重要的意义。

何首乌对肝脏的作用具有“有故无殒”现象，表现为高剂量何首乌可导致正常动物肝损伤，对于慢性肝损伤模型动物却具有肝保护和治疗作用[18]。目前的研究主要关注何首乌炮制前后导致毒性[19-20]、血清代谢组学[21]和尿液代谢组学[22-24]的差异；特异质动物模型评价生、制何首乌的肝损伤[25-26]；单体成分对Ⅰ相和对Ⅱ相代谢酶影响的研究[27-28]等方面。以何首乌肝损伤为例，王伽伯等[29]构建基于整合证据链的中药肝毒性客观辨识的策略和方法，并从易感人群筛查、炮制减毒、配伍减毒及辨证用药减毒等关乎临床合理用药的问题进行系统分析，为科学评价中药肝损伤风险、构建合理用药保障技术体系提供研究思路和方法学参考。本实验室在何首乌肝损伤方面做了一些原创性研究，李丹丹[30-31]通过建立3D肝毒性评价模型并对何首乌肝毒性机制进行探索，发现生何首乌与制何首乌均能引起模型氧化应激和内质网应激反应，通过降低线粒体膜电位对线粒体功能造成损伤。生首乌的毒性早期主要由氧化应激引起，后期包括内质网应激；制首乌的毒性早期主要由内质网应激引起，后期伴有一定的氧化应激的现象。近期研究报道，李婷婷等[32]采用液滴重叠法成功构建类器官3D培养模型，并评价何首乌中有效成分顺式THSG的肝损伤作用，发现何首乌易感物质顺式THSG对3D器官模型的肝毒性大于反式THSG，提示长期用药可能增大何首乌肝损伤风险。

何首乌中THSG和蒽醌类成分会导致肝损伤[33-35]。基于实验室先前构建的CYP3A4质粒和PXR质粒，本研究利用双荧光素酶报告基因法，采用目的基因与调控基因质粒共转染HepG2细胞，发现空载质粒pcDNA3.1与pGL4.17-CYP3A4共转染时，THSG、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸均对CYP3A4有抑制作用，调控基因质粒pcDNA3.14-PXR与pGL4.17-CYP3A4共转染时THSG、大黄素甲醚、大黄酸产生诱导效应；大黄素对CYP3A4有直接诱导作用。上述结果表明何首乌中的成分（二苯乙烯苷类和蒽醌类）能够通过PXR对CYP3A4产生调节作用，联合用药时应注意潜在肝损伤风险，在临床使用时应密切监测肝功能的变化，避免产生肝损伤。

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