HLA-SSO基因分型技术

李代红（天津市第一中心医院输血科，天津 300192）

HLA-SSO基因分型采用序列特异性寡核苷酸（sequence specific oligonucleotide，SSO）引物来鉴定PCR扩增产物中的等位基因。该方法基于标记的单链PCR产物与SSO探针进行杂交，通过PCR扩增，获得单链及双链混合PCR产物，用于扩增的引物标记有生物素，因此扩增所得的PCR产物均被生物素标记。双链PCR产物经过变性解链成单链，所有单链与微珠上的SSO探针特异性结合，然后用荧光标记，之后与生物素结合，利用Luminex平台进行HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类等位基因的DNA分型。该技术可用于固体器官（肾、胰腺、心脏、肺等）移植和细胞移植前HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类的DNA分型检测，疾病关联分析，群体遗传研究分析和药物过敏研究。实验采用枸橼酸钠抗凝的患者外周血，采用特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取血液中的基因组DNA，终浓度为50 ～ 100 ng/μl。按照每个反应孔Master Mix : ddH20 : Taq酶 : 模板DNA以6 : 11.8 : 0.2 : 2 （μl） 的比例进行PCR扩增。将 60℃ 预热的相应位点的Probe Mix与产物按照7.5 : 2.5 （μl） 加至96孔反应板中混合，于PCR仪中杂交。杂交结束后，56℃ 下，每孔加入 85 μl Dilution solution/PE-Streptavidin 混合液。利用Luminex 200液相芯片分析系统，通过SSO探针所获得的相关信号进行HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类等位基因的分型。本实验中采用的SSO探针在设计中包含中国常见及确认的HLA 等位基因（CWD）的标识功能，因此，在CWD过滤条件下，可以达到30% 以上的高分辨率结果。