供体特异性抗体检测在肝移植中的作用

李先亮，刘向军，姚远（首都医科大学附属北京朝阳医院肝胆脾胰专科，北京 0000；北京博富瑞基因诊断技术有限公司，北京 0076）

近年来，我国肝移植发展迅猛，已逐渐成为各种终末期肝病的有效治疗手段［1-2］。随着肝移植外科手术水平的提高、肝脏冷缺血保存技术的发展、新型免疫抑制药在临床逐渐推广应用，肝移植患者手术后早期生存率有显著的提高。但在长期的肝移植受体中，由抗体介导排斥反应（antibodymediated rejection，AMR）导致的慢性移植肝失功及其相关并发症仍是影响肝移植受体长期存活的主要原因。肝移植临床配型中，人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型和HLA抗体检测是其中一种可能的原因。如何通过HLA配型和HLA抗体检测技术优化肝脏资源选取，避免患者预存有供体HLA抗体，及早检测出新生供体特异性抗体（donor-specific alloantibodies，DSA），避免AMR的发生，提高移植后的患者存活率，应该是肝移植长期存活的受体研究中需要关注的问题。

1 肝移植的免疫耐受理论

在以往的研究中，肝脏因具有特惠的移植免疫特性，其排斥反应明显轻于其他移植器官，往往被认作是“免疫豁免器官”，因此肝脏容易产生免疫耐受［3］。这种特性的产生主要有两个客观原因：① 患者进行肝移植后，供体肝脏产生的大量分泌型MHC-Ⅰ可以有效诱导细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）凋亡，延长移植物的存活时间［4］。② 肝脏过客细胞较多，约为25% ～50%，这种供受体间大量游走会逐渐形成微嵌合体［5］，最终使移植物被受体接受，有利于移植物的长期存活［5］。因此，肝移植一般不需要特别严格的HLA配型和HLA抗体的检测。但随着免疫学的不断发展，有了新的研究发现，肝脏的排斥反应明显轻于其他器官移植并不是全因其具有免疫特惠的特性，而是因为肝脏具有强大的再生能力，通过排斥反应死亡的肝脏细胞迅速再生，使肝脏的功能在排斥反应中依然保持稳定［6］。

2 HLA抗体检测技术

2.1 HLA抗体检测技术的发展：随着体液免疫理论的不断完善和群体反应性抗体（panel reactive antibodies，PRA）检测技术的发展，临床医生逐渐认识到在急性、超急性、加速排斥反应中，可能也有体液免疫参与，其中HLA抗体能迅速或缓慢地召集血液中的补体，造成移植物损伤，引起临床意义上的排斥反应［7］。基于酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技术的PRA检测已逐渐成为移植术前的常规检测项目［8］，但其具有精度低、耗时长、结果容易受到操作人员水平影响等缺陷。而在此基础上发展的基于Luminex 的单抗原珠（luminex single antigen beads，LSAB）技术，同样通过高特异的双抗体选择，但可以在一次实验中完成多个目标的HLA抗体分析，从而颠覆了过去的检测体系，建立了一个高效快速的HLA分析和HLA抗体检测的分析平台［9-10］。

2.2 基于Luminex技术的HLA抗体检测：Luminex技术应用了微球和流式细胞仪的原理，其中微球内含有红色和绿色两种荧光，通过荧光的深浅不同，Luminex平台可以区分100种不同的微球［11］。每种微球可以用来检测一种不同HLA抗体或基因。该技术利用荧光编码的微球共价交联HLA单克隆抗体或HLA分子探针，与被测定的HLA抗原或DNA结合后，加入二抗作为荧光标记，再通过激光扫描微球的荧光编码识别编码和测量目的荧光的平均强度（median fluorescent intensity，MFI）［12］。基于Luminex平台的HLA抗体检测技术，在使用相同抗体的条件下，测量结果在准确度、灵敏度和精确度上均与ELISA实验达到相同水平，但因其通量的大幅度增加，对HLA抗体的检测个数由原来ELISA技术的20多个上升为100个，且操作时间更短［13］，是一种更适合为临床提供服务的检测技术体系。

2.3 HLA抗体检测在器官移植中的作用：随着器官移植免疫理论的不断发展，HLA配型与HLA抗体检测已在肾移植和心脏移植临床中被广泛运用。国内外研究机构的临床研究表明，HLA配型与DSA存在与肾移植术后早期排斥反应、AMR及移植物长期存活都有着密切关系。法国圣路易斯医院的肾移植科对402例肾移植患者进行研究，研究结果表明，术前预存DSA的患者（60.8%），8年的肾存活率远低于预存非DSA（83.6%）或PRA阴性患者（92.5%）［14］。英国哈特菲尔德医院移植免疫科对243例心脏移植患者进行分析发现，术后产生新生DSA的患者十年存活率仅为62%，而没有产生新生DSA患者的十年存活率却达到89%［15］。英国剑桥医学院对131例准备进行再次肾移植的患者进行分析，发现DSA的发生与HLA位点的错配个数或Epitope的错配个数存在明显的正相关关系［16］。预存或新生DSA在器官移植中的致病作用，除了在肾移植和心脏移植有详细的研究报道外，还在肺移植［17］和胰腺移植［18］中有所报道。

3 肝移植患者DSA与急性排斥反应的产生

3.1 PRA产生原理：患者在移植前，曾经历过输血、妊娠或其他器官移植都有可能使体内预存PRA。研究发现，器官移植产生的HLA抗体概率较高，妊娠产生的HLA抗体概率次之，而输血产生HLA抗体的概率较低［19］。但因为各种原因，部分患者进行输血的次数会较多，研究发现患者经过反复有规律的的输血，产生HLA抗体的频率可高达50%［20］。

3.2 PRA与肝移植术后的急性排斥反应：肝移植后发生急性排斥反应的体液免疫学机制是移植肝的肝细胞表面HLA-Ⅰ类抗原与胆管上皮细胞表面的HLA-Ⅱ类抗原与患者体内预存的HLA抗体结合，形成抗原抗体复合物，并通过激活补体经典途径的级联反应形成攻膜复合体，直接损害移植肝的肝细胞与胆管上皮细胞［21］。另外，由于供受体之间的HLA抗原产生差异，移植肝进入受者体内后，供肝的HLA抗原被受体提呈，通过辅助T细胞的作用，激活CD8+T细胞攻击移植肝脏，另一方面，CD4+T细胞释放的多种细胞因子也会通过巨噬细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）等间接或直接的攻击靶细胞［22］。

3.3 肝移植后急性排斥反应的症状：肝移植后急性排斥反应的症状包括肝功能紊乱、血小板下降、补体水平和DSA水平上升、肝活检显示微血管炎性损伤［23］。这些急性排斥反应症状最早可发生于术后的第2天，通常在肝移植后的数周内发生，其发生率随时间推移而下降。肝脏因为有强大的再生能力，使其具有一定的术前DSA的吸收能力，早期因为AMR产生的肝细胞损伤、肝内胆汁淤积及胆道并发症都有可能被肝脏的再生能力掩盖，使患者没有出现相应的病例症状［24-25］。这一情况给我们通过病理学研究DSA与肝移植结果带来了困难。研究发现，在正常肝移植患者中急性排斥反应发生的概率非常罕见，因此造成的移植肝功能失功只占移植肝失功的1%，但对于预存有DSA的患者，急性排斥反应造成的移植肝功能失功却占到移植肝失功的 10%［25］。

3.4 预存DSA抗体与肝移植术后产生急性排斥反应的关系：早前已有临床研究表明，在进行肝移植的患者当中，补体依赖的微量淋巴细胞毒实验（complement dependent cytotoxity ， CDC）阳性患者的移植肝存活率远低于CDC阴性患者［26-27］。随着基于Luminex的HLA抗体检测技术的成熟，几个研究单位都利用这一先进快捷的检测技术对患者预存DSA与肝移植急性排斥反应之间的关系进行研究。Taner等［28］研究发现，85%的肝移植患者预存的DSA将会在移植后消失，但大部分DSA没有消失且具有较高MFI的患者均会产生AMR。Kozlowski等［29］研究发现，79%的术前T细胞或B细胞CDC阳性患者，肝移植后CDC会变成阴性，但是CDC持续阳性的患者将会产生严重的急性AMR。这一结果说明，肝脏虽然有强大的修复能力去减少DSA带来的损伤，直至预存DSA耗尽，但一旦预存DSA的含量强于肝脏的自我修复能力，肝脏就会受到严重的病理损伤。O'Leary等［30］发现23%的患者在肝移植后，体内依然保持有术前预存的HLA-Ⅱ DSA，且MFI＞5 000 ，这一因素与移植肝功能失功存在明显的单因素正相关关系。Castillo-Rama等对896例肝移植患者进行回顾性研究，发现预存的HLA-I DSA与HLA-ⅡDSA或CDC阳性患者均与移植肝功能失功和死亡风险存在明显的正相关性。另外，Musat等［31］发现患者预存DSA在肝移植术后发生急性细胞排斥反应的风险明显增加。

3.5 患者新生DSA与移植肝存活：虽然肝脏强大的再生功能使我们研究DSA与肝移植的结果存在困难，但最近也有不少研究单位对此作出了报道。Kaneku 等［32］研究发现，肝移植后1年内新生DSA的概率为8.2%，且进一步研究表明1年内产生新生DSA的患者比没有产生新生DSA受体的患者存活率低［32-33］。Goh等［34］对139例再次进行活体肝移植的受体进行研究分析，发现HLAⅠ类抗体与移植物损伤存在明显的正相关关系。Musat等对43例肝移植后发生急性排斥反应或慢性排斥反应的患者进行肝活检，C4d染色后发现，患者C4d的沉积量与DSA强度存在明显的正相关。且随后的研究表明肝移植后产生DQ DSA的患者，发生慢性排斥反应的概率高于产生非DQ DSA的患者，这一研究结果与其他器官移植的临床研究结果相吻合［35］。另外，该研究表明，肝移植受体术后新生DSA的MFI值越高，慢性排斥反应的发生风险越高［36］。进一步的研究对IgG亚型与肝移植慢性排斥反应的相关性做了分析，研究发现患者体内具有多种DSA IgG亚型,比单种DSA IgG亚型更容易产生慢性排斥反应（50% 比 14%），且IgG3亚型与移植物存在着明显的正相关［37］。

4 总 结

因为肝移植免疫特惠理论和临床肝移植免疫排斥反应轻微的原因，我们一直忽略了DSA在肝移植后的损害作用，并在临床中一直忽视肝移植的HLA配型和DSA的监测，缺乏相应的肝脏移植AMR临床诊断指标。移植肝脏具有强大的自我再生能力，使其能承受患者预存DSA造成的早期肝损伤。近几年的临床研究逐渐表明，DSA与肝移植术后的急性排斥反应、AMR发生与移植肝存活时间存在明显的正相关，如果术前预存的HLA II类抗体较多，产生的肝损伤强于肝自身的恢复能力，就会产生强烈的急性排斥反应，降低移植受体的存活率。相比于肾移植和心脏移植，对于如何利用DSA指导肝移植临床筛选供体和用药还在起步阶段。未来还需要利用更大规模的肝移植受体进行DSA与病理学结果的分析，并思考如何共同利用DSA MFI值、DSA IgG亚型、DSA召集补体C1q和C3d这些指标，共同预测肝移植后急性排斥反应和慢性排斥反应的发生，期望达到最佳肝脏移植存活效果。