双膦酸盐治疗骨质疏松导致的Th17与Treg细胞因子分泌失调的效果

李　沁　陈登科

(遵义市第一人民医院老年病科，贵州　遵义　563000)

免疫系统动态调节骨骼的平衡〔1〕。参与调控骨骼重构的主要有成骨细胞和破骨细胞〔2〕。大量炎症疾病，如类风湿疾病、炎症性肠道疾病、癌症、骨质疏松等负向地影响骨骼重构，它们往往通过影响成骨作用来打破这种平衡〔3〕。由于破骨细胞对骨质的过量吸收，往往会导致骨骼的破坏，这一个过程的形成被CD4T细胞间接或直接调控〔4，5〕。T细胞通过直接作用于破骨细胞的前体细胞，可以诱导破骨细胞的分化〔6〕。T细胞对于破骨细胞形成的影响，依赖于其所分泌的正向调控与负向调控因子之间的平衡作用。双膦酸盐为普遍认可的破骨细胞形成抑制剂，临床上被广泛用于治疗多种系统性的骨骼代谢疾病〔7〕。本文探究骨质疏松患者在双膦酸盐治疗后CD4T细胞的变化。

1　材料与方法

1.1受试者样本选取广西省人民医院就诊的骨质疏松患者。年龄38～75岁，自愿参加本研究，研究前均未接受其他治疗。年龄相匹配健康正常人为对照组。均经过受试者的书面同意书，经医院伦理委员会批准。

1.2外周血单个核细胞提取取受试者(治疗1年)25 ml外周血，采用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)梯度离心。

1.3细胞刺激与酶联免疫吸附(ELISA)分析将分离得到的细胞重悬在1 ml细胞培养基中，加入50 ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和1 μg/ml离子霉素，37℃细胞培养箱中刺激5 h后收上清，用ELISA试剂盒测细胞因子含量。采用ELISA检测骨质疏松患者与对照组辅助性T细胞(Th)1与Th2细胞分泌情况，并分析CD4T另两个亚群Th17与Treg细胞的变化。

1.4RT-PCR分析将细胞提取RNA，反转录成cDNA，进行RT-PCR检测。分析Th17与Treg特异的转录因子RORγt与FOXP3的表达情况。

1.5试剂细胞培养基〔RPMI，10%胎牛血清(FBS)，55 μmol/L 2-硫基乙醇，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 μg/ml庆大霉素，链霉素青霉素〕ELISA试剂盒购自ebioscience公司，RT-PCR试剂盒购于TAKARA公司。

1.6统计学方法应用Graph Pad Prism5.0软件进行非配对t检验。

2　结　果

2.1双膦酸盐对Th1、Th2细胞因子分泌的影响骨质疏松患者Th1细胞分泌的细胞因子干扰素(IFN)γ〔(2 038.7±7.1)pg/ml〕、白细胞介素(IL)-12表达水平〔(727.2±3.1)pg/ml〕与对照组〔(2 073.3±7.5)pg/ml、(711.7±3.2)pg/ml〕差异无统计学意义(P=0.23，0.15)。骨质疏松患者Th2细胞分泌的细胞因子IL-4、IL-5〔(822.2±2.5)pg/ml、(2 919.5±6.3)pg/ml〕与对照组〔(838.7±2.9)pg/ml、(3 033.3±6.9)pg/ml〕差异无统计学意义(P=0.36，0.093)。

2.2双膦酸盐对Th17与Treg细胞因子分泌的影响骨质疏松患者Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A与IL-23表达水平〔(78.8±2.2)pg/ml、(77.2±1.8)pg/ml〕显著低于对照组〔(123.5±3.1)pg/ml、(171.7±3.5)pg/ml；P=0.000 53，0.003 9〕。而Treg细胞分泌的细胞因子IL-10、TGF-β水平〔(3 722.6±7.9)pg/ml、(4 119.2±9.4)pg/ml〕显著高于对照组〔(2 838.7±6.3)pg/ml、(3 233.7±8.5)pg/ml；P=0.003 6，0.002 3〕。

2.3双膦酸盐治疗后Th17与Treg细胞转录因子表达变化Th17细胞特异的转录因子RORγt在骨质疏松患者中表达水平(0.013 4±0.001 5)显著低于对照组(0.032 5±0.002 1，P=0.004 6)。而Treg细胞特异的转录因子FOXP3在骨质疏松患者中(0.055 2±0.002 1)显著高于对照组(0.023 8±0.001 6，P=0.001 4)。

3　讨　论

骨质疏松是一种慢性、渐进性功能障碍疾病。由于骨质吸收超过骨质形成，致使骨量下降和微体系结构恶化，导致了骨的强度下降和增加骨易碎性的结果〔8〕。炎症性的T细胞亚群可以触发破骨细胞的形成，而Treg细胞被认为是执行一个不同的效应〔9〕。

许多细胞因子，包括IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6和IL-11，已经被报道可以促进骨质吸收〔10～14〕。双膦酸盐能显著降低Th17细胞因子是一个非常重要的发现。产生IL-17的Th17细胞是破骨细胞形成的重要激活子〔4〕。在体外研究也发现，Th17细胞可以促进破骨细胞的形成，也因此被认为是Th亚群中最与破骨形成相关的细胞〔9〕。本研究结果显示，骨质疏松患者在接受了双膦酸盐治疗后，Th17细胞因子分泌下降，而同时Treg细胞因子分泌上升。

1Baker PJ.The role of immune responses in bone loss during periodontal disease〔J〕.Microbes Infect，2000；2(10)：1181-92.

2Teitelbaum SL.Bone resorption by osteoclasts〔J〕.Science，2000；289：1504-8.

3Sato K，Takayanagi H.Osteoclasts，rheumatoid arthritis，andosteoimmunology〔J〕.Curr Opin Rheumatol,2006;18(4)：419-26

4Feng X，McDonald J.Disorders of bone remodeling〔J〕.Annu Rev Pathol，2011；6(2)：121-45.

5Sato K，Suematsu A，Okamoto K，etal.Th17 functions as an osteoclastogenichelper T cell subset that links T cell activation and bonedestruction〔J〕.J Exp Med，2006；203(12)：2673-82.

6Kong YY，Feige U，Sarosi I，etal.Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand〔J〕.Nature，1999；402(6759)：304-9.

7Suresh E，Pazianas M，Abrahamsen B.Safety issues with bisphosphonate therapy for osteoporosis〔J〕.Rheumatology，2014；53(1)：19-31.

8Rachner TD，Khosla S，Hofbauer LC.Osteoporosis：now and the future〔J〕.Lancet，2011；377(9773)：1276-87.

9Sakaguchi S，Ono M，Setoguchi R，etal.Foxp3-CD25-CD4-natural regulatory T cells in dominant self-tolerance andautoimmune disease〔J〕.Immunol Rev,2006；212(1)：8-27.

10Gowen M，Wood DD，Ihrie EJ，etal.Aninterleukin 1- like factor stimulates bone resorption in vitro〔J〕.Nature,1983；306(5941)：378-80.

11Bertolini DR，Nedwin GE，Bringman TS，etal.Stimulation of bone resorption and inhibition of bone formation in vitro by human tumour necrosis factors〔J〕.Nature,1986；319(6053)：516-8.

12Hill PA，Tumber A，Papaioannou S，etal.The cellular actions of interleukin-11 on bone resorption in vitro〔J〕.Endocrinology,1998;139(4)：1564-72.

13Ishimi Y，Miyaura C，Jin CH，etal.IL-6is produced by osteoblasts and induces bone resorption〔J〕.J Immunol,1990；145(10)：3297-303.

14Miyaura C，Kusano K，Masuzawa T，etal.Endogenous bone-resorbing factors in estrogen deficiency：cooperative effects of IL-1 and IL-6〔J〕.J Bone Miner Res,1995；10(9)：1365-73.