P16、RAR-β和APC基因甲基化联合脱落细胞学检测对恶性浆膜腔积液的诊断价值*

郭建华,张吉才,李 霞,吕 军,伍亚云,朱名安,汤显斌,瞿华琴,杨广全,杜 毅

(1.湖北省十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院检验科 442000;2.湖北医药学院生物医学工程学院，十堰 442000；3.湖北省竹山县妇幼保健院检验科 442200；4.湖北省十堰市中西医结合医院检验科 442000；5.湖北省十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院病理科 442000；6.湖北省竹溪县中医院检验科 442300)

浆膜腔积液指在疾病情况下，胸腔、腹腔或心包腔内积聚的过多液体。恶性浆膜腔积液是恶性肿瘤的常见并发症之一，对其准确诊断有助于判断患者的疾病状态。细胞病理学检查是确定浆膜腔积液良恶性的常用方法，但其诊断的灵敏度只有40%～90%，可能造成误诊而延误治疗[1]。肿瘤标志物及细胞因子如CA125、组织型纤溶酶原激活因子(TPA)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)等对恶性浆膜腔积液诊断被认为都有潜在价值，然而灵敏度和特异度低等问题使其只能作用联合诊断的依据[2]。因此，寻找一种能够早期及时准确判断浆膜腔积液良恶性的方法至关重要。

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的介导下，将甲基选择性添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的过程。大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展及细胞癌变有着密切的联系，是除缺失和突变之外导致抑癌基因表达失活的一个重要特征[3]。检测SHOX2和SEPT9基因甲基化有助于对恶性浆膜腔积液的诊断[4]。

P16、视黄酸受体β(retinoic acid receptor beta，RAR-β)、结肠腺瘤性息肉病 (adenomatous polyposis coli，APC)基因都是肿瘤抑癌基因，与多种肿瘤相关，检测P16基因在胸腔积液的甲基化有助于鉴别良恶性胸腔积液[5]。本研究拟采用甲基化特异度PCR方法联合检测浆膜腔积液沉淀细胞P16、RAR-β和APC基因甲基化状态，探讨其对恶性浆膜腔积液诊断价值，为临床早期准确诊断浆膜腔积液良恶性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞来源 收集2015年1月至12月就诊于湖北医药学院附属太和医院的患者浆膜腔积液65例，其中心包积液8例，腹腔积液9例，胸腔积液48例。患者于入院后1周内行穿刺，抽取积液10 mL ×2管，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，1 000 r/min离心15 min，1管取沉淀细胞若干于-80 ℃保存备用。另1管取细胞沉淀物作脱落细胞学检查。65例浆膜腔积液中，良性27例，男7例，女20例，年龄16～82岁，中位年龄65岁，均为抗感染或抗结核治疗有效且确诊；恶性38例，男21例，女17例，年龄42～82岁，中位年龄60岁，均经病理及临床检查确诊。

1.1.2试剂和仪器 使用碧云天基因组DNA小量抽提试剂盒对沉渣细胞中的基因组进行抽提、一步法亚硫酸盐处理试剂盒购自北京天漠，CpG甲基化酶(M.SssI)为NEB产品，引物由上海桑尼生物合成；PCR mix、100bp ladder、Nano Drop2000核酸蛋白检测仪及超低温冰箱为Thermo产品，凝胶成像仪为Sysgene产品，电泳仪为北京六一产品。日产OLYMPUS CX-31显微镜，苏木精-伊红(HE)染色液(自配)。

1.2方法

1.2.1脱落细胞学检查 浆膜腔积液10 mL，EDTA抗凝，1 000 r/min离心15 min，取细胞沉淀物人工推片3张，自然干燥，HE染色，3张染色片均在显微镜下仔细查找癌细胞，并依据细胞学特征进行分型。27例良性浆膜腔积液均未找到癌细胞；38例恶性浆膜腔积液中，腺癌14例，鳞癌11例，未分化癌3例，可疑癌细胞10例。但38例恶性浆膜腔积液患者，均经病理或临床确诊为恶性肿瘤。

1.2.2基因组DNA的提取及亚硫酸盐处理 参照试剂盒说明书对沉渣细胞进行基因组DNA提取，使用Nano Drop2000检测抽提DNA的浓度和纯度，保证所提取DNA的OD260/OD280为1.6～1.8。参照说明书亚硫酸盐处理法对DNA进行甲基化处理。其中用CpG甲基化酶(M.SssI)处理人淋巴细胞基因组做甲基化基因的阳性对照。CpG甲基化酶(M.SssI)能识别并甲基化CpG识中所有C,使其与MSP方法所理想的DNA状态一致，可模拟生物基因组的修饰模式，故可用来做阳性对照；以人淋巴细胞基因组为未甲基化基因的阳性对照。

1.2.3PCR扩增 以甲基化修饰后的DNA为模板，分别用3个基因的甲基化和非甲基化特异度引物进行PCR扩增，引物序列及产物大小详见表1，引物设计参见文献[6]。PCR反应体系为PCR mix 10 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物 (10 μmol/L)，DNA模板1 μL灭菌蒸馏水加至20 μL。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行检测。

2 结 果

2.1P16、RAR-β和APC甲基化和非甲基化基因扩增 对27例良性浆膜腔积液和38例恶性浆膜腔积液中的基因组进行抽提，并行亚硫酸盐处理。甲基化特异度PCR技术对P16、RAR-β和APC基因进行启动子区域甲基化检测。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后，与Marker相比P16、RAR-β和APC甲基化和非甲基化基因均得到扩增，且与预计大小相同，见图1。

表1 引物序列及片段大小

MF:甲基化的正向引物；MR：甲基化的反向引物；UF：未甲基化的正向引物；UR：未甲基化的反向引物

2.2P16、RAR-β和APC三基因启动子甲基化及脱落细胞分析在两组中频率的统计学分析 在27例良性浆膜腔积液中，P16启动子甲基化的频率为25.9%，RAR-β为37.0%，APC为7.4%；38例恶性浆膜腔积液中P16启动子甲基化的频率为39.5%，RAR-β为66.7%，APC为28.9%。P16基因和RAR-β基因的甲基化频率进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。APC基因甲基化频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。良性组中至少两个基因启动子甲基化阳性率为7.4%，恶性中阳性率为36.8%，两组比较，差异有统计学意义(χ2=7.370,P=0.007)，见表3。对基因进行两两分析，良性组中P16和RAR-β基因启动子同时甲基化的频率为7.4%，不存在RAR-β和APC基因启动子同时阳性，与恶性组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

A:P16为150 bp；B：RAR-β为150 bp；C：APC为100 bp。启动子CG岛进行甲基化特异度PCR(MSP)扩增后行1.5%琼脂糖电泳，Marker为100 bp ladder。M：甲基化基因；U：未甲基化基因。NC为阴性对照，PC为阳性对照，3个基因均在 65号样本中进行MSP检测

图1启动子CG岛甲基化PCR后电泳图

表2 不同组中单基因的甲基化情况[n(%)]

M：甲基化基因；U：未甲基化基因

在65例样本行脱落细胞学分析，发现27例临床综合诊断为良性疾病的样本中可疑阳性1例，细胞学阳性1例；38例恶性浆膜腔积液中阳性诊断26例，可疑3例。脱落细胞联合各基因即脱落细胞和甲基化检测有1个为阳性，联合任意基因进行良恶性胸腔积液的鉴定，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表3 不同组的甲基化状态[n(%)]

2.3P16、RAR-β和APC 3基因启动子甲基化诊断良恶性浆膜腔积液的灵敏度和特异度 单独甲基化检测方面发现至少两个基因发生甲基化的灵敏度为36.8%，特异度为92.6%，阳性预测值为87.5%，阴性预测值为51.0%，其中RAR-β、APC同时甲基化的特异度为100.0%。脱落细胞联合甲基化检测后灵敏度普遍升高，但特异度降低，见表6。

表4 两基因启动子甲基化阳性的数目[n(%)]

表5 脱落细胞学联合各基因启动子甲基化分析在不同积液中的频数(n)

M：甲基化基因；U：未甲基化基因

表6 不同基因启动子甲基化状态对诊断良恶性浆膜腔积液的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分析(%)

3 讨 论

1993年SERRANO等[7]首次克隆得到的编码肿瘤抑制蛋白P16的cDNA，从那时起P16基因就经常应用于肿瘤研究领域。P16基因属于周期依赖性激酶抑制因子(CDK1) 基因家族，位于染色体9p21，其蛋白产物调节细胞增殖与凋亡，阻止DNA损伤的细胞进行分裂增殖[8]。近年来，有研究表明P16基因启动子区CpG岛甲基化，会导致基因转录终止，引起基因失活[9]。P16基因可以通过与细胞周期蛋白D1结合竞争性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4、CDK6)的活性，从而降低 Rb蛋白的磷酸化程度，抑制转录因子E2F的释放，阻止细胞从G0期进入S期，抑制细胞增殖[10]。P16基因表达下调或失活的情况下很有可能引起细胞异常分裂增殖、最终生长失去控制，导致细胞恶性变[8]。本研究发现P16基因在恶性浆膜腔积液中的甲基化率为39.5%，在良性浆膜腔积液中的甲基化率为25.9%，恶性积液中的甲基化率高于良性组，但差异无统计学意义(P>0.05)，与LIU等[5]的研究结果有一定的差异，可能是由于本试验中样本为浆膜腔积液而刘大鹰等的研究则为单纯的胸腔积液；但本试验结果显示出的恶性和良性组间的差异趋势与以往的研究相同。

RAR-β基因，又称为核受体亚家族1，B群，2组(nuclear receptor subfamily 1,group B,member 2，NR1B2)。RAR-β蛋白与维生素A的生物活性形式视黄酸结合介导胚胎发育、细胞增殖和分化过程中的细胞信号转导。HUA等[11]分析表明与自体对照RAR-β启动子在小细胞肺癌组织中高甲基化，因此RAR-β可以成为诊断小细胞肺癌的潜在诊断指标。

APC基因，位于5q22.2，是一种抑癌基因[12]。APC蛋白可以抑制β连环蛋白的浓度，与E-钙黏蛋白相互作用调节细胞的黏附功能。APC基因突变可能会引起结直肠癌的发生[13]。研究表明，在胃肠道癌症，肺癌和乳腺癌中APC基因1A启动子发生甲基化和基因的沉默表达[14]。本研究发现APC基因在良性组中的甲基化频率为7.4%，恶性中的甲基化频率为28.9%，两组中的差异有统计学意义(P<0.05)。同时其诊断的特异度较高，达到92.6%，阳性预测值为84.6%，表明该基因阳性时，浆膜腔积液为恶性的可能性较大。

本研究显示RAR-β在恶性浆膜腔积液中的甲基化频率为66.7%，良性的甲基化频率为37.0%。RAR-β和APC同时阳性诊断恶性浆膜腔积液的特异度为100.0%，两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。同样统计学研究发现3基因至少两个基因发生甲基化及P16和(或)RAR-β启动子发生甲基化在良性和恶性肿瘤中差异有统计学意义(P<0.05)。脱落细胞学联合甲基化基因检测可以提高诊断的灵敏度，但特异度降低，但用两种方式联合区分恶性和良性浆膜腔积液的差异有统计学意义(P<0.05)。其中脱落细胞学联合APC甲基化阳性或联合至少两基因阳性具有较高的诊断灵敏度和特异度。因此，浆膜腔积液P16、RAR-β和APC基因甲基化联合脱落细胞学检查对良、恶性浆膜腔积液有鉴别诊断价值。

[1]PORCEL J M,LIGHT R W.Pleural effusions[J].Dis Mon,2013,59(2):29-57.

[2]黄浩，陶义丰，黄玲莎．良恶性浆膜腔积液鉴别诊断研究进展[J]．医学检验与临床，2014，25(5)：61-63．

[3]WAJED S A,LAIRD P W,DEMEESTER T R.DNA methylation:An alternative pathway to cancer[J].Ann Surg,2001,234(1):10-20.

[4]DIETRICH D,JUNG M,PUETZER S,et al.Diagnostic and prognostic value of SHOX2 and SEPT9 DNA methylation and cytology in benign,paramalignant and malignant pleural effusions[J].PLoS One,2013,8(12):e84225.

[5]LIU D Y,ZHOU F L,HU Z J,et al.J[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2010,30(9):2148-2150.

[6]HONORIO S,AGATHANGGELOU A,WERNERT N,et al.Frequent epigenetic inactivation of the RASSF1A tumour suppressor gene in testicular tumours and distinct methylation profiles of seminoma and nonseminoma testicular germ cell tumours[J].Oncogene,2003,22(3):461-466.

[7]SERRANO M,HANNON G J,BEACH D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J].Nature,1993,366(6456):704-707.

[8]GAN X N,LIN X M,HE R,et al.Prognostic and clinicopathological significance of downregulated p16 expression in patients with bladder cancer:a systematic review and Meta-Analysis[J].Dis Markers,2016(1):5259602.

[9]DEINNOCENTES P,AGARWAL P,BIRD R C.Phenotype-Rescue of Cyclin-Dependent kinase inhibitor p16/INK4A defects in a spontaneous canine cell model of breast cancer[J].J Cell Biochem,2009,106(3):491-505.

[10]LLOMBART-BOSCH A,YURAKH A,LOPEZ-GUERRERO J A,et al.Molecular and immunohistochemical analysis of the prognostic value of cell-cycle regulators in urothelial neoplasms of the bladder[J].Modern Pathol,2006,19(1):148.

[11]HUA F,FANG N Z,LI X B,et al.A Meta-Analysis of the relationship between RAR beta gene promoter methylation and Non-Small cell lung cancer[J].PLoS One,2014,9(5):e96163.

[12]NISHISHO I,NAKAMURA Y,MIYOSHI Y,et al.Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer patients[J].Science,1991,253(520):665-669.

[13]MARKOWITZ S D,BERTAGNOLLI M M.Molecular origins of cancer:molecular basis of colorectal cancer[J].N Engl J Med,2009,361(25):2449-2460.

[14]HONORIO S,AGATHANGGELOU A,WERNERT N,et al.Frequent epigenetic inactivation of the RASSF1A tumour suppressor gene in testicular tumours and distinct methylation profiles of seminoma and nonseminoma testicular germ cell tumours[J].Oncogene,2003,22(3):461-466.