PD-L1在人胶质瘤中的表达及其对肿瘤内浸润性T细胞凋亡的影响*

李巧转,李 娴

(1.解放军第101医院病理科,江苏无锡 214044；2.重庆医科大学病理教研室 400016)

胶质瘤是十分常见的中枢神经系统肿瘤，恶性度高，患者生存率低。程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)是免疫球蛋白家族的一种膜蛋白，在继发感染中对免疫介导的组织损伤有重要的保护作用，它包含程序性死亡-配体1(PD-L1)和程序性死亡-配体2(PD-L2)两种抑制性配体。研究表明，PD-L1在非小细胞肺癌、卵巢癌、肾细胞癌等众多肿瘤高表达[1-3]。本实验采用免疫组织化学法观察PD-1/PD-L1在人胶质瘤组织中的表达，分析其与临床病理特征相关性。TUNEL法检测胶质瘤内浸润性淋巴细胞的凋亡，流式细胞术分析PD-L1促进胶质瘤患者外周血中活化T细胞的凋亡情况，为胶质瘤免疫治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 正常脑组织18例选自脑外伤脑出血患者，胶质瘤组织80例均取自解放军第101医院病理科2007-2011年的病理标本，术前未经化疗、放疗与激素治疗，病理诊断明确且有完整的临床病理资料，均取得知情同意。其中男45例，女35例，年龄6～75岁，平均(47.5±5.4)岁。根据WHO中枢神经系统肿瘤分型(2011年版)进行分级，Ⅰ级3例，Ⅱ级24例，Ⅲ级20例，Ⅳ级33例。病例资料的随访通过电话和户籍查访两种方法进行，随访时间大于或等于60个月，随访成功54例(67.5%)。胶质瘤患者外周血选取术后确诊在院的胶质瘤Ⅳ级患者(因Ⅳ级患者PD-L1的表达率高)，均取得患者及家属同意。

1.2方法

1.2.1试剂 一抗PD-1(克隆号UMAB199)，PD-L1(克隆号UMAB228)，PD-L2(克隆号UMAB223),CD3(克隆号UMAB54)和二抗检测试剂PV8000均购自无锡傲锐东源生物科技有限公司。

1.2.2免疫组织化学方法 采用的10%中性甲醛固定石蜡包埋组织，4 μm脱蜡水化组织切片，热修复后磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，放置H2O2中孵育15 min，滴加一抗孵育过夜(4 ℃)，二抗室温孵育30 min后经二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染。免疫组织化学结果判断：(1)首先用光学显微镜进行观察，PD-L1、PD-1主要定位于胶质瘤细胞质或细胞膜，阳性染色为细胞质出现黄色或者褐色颗粒，呈弥漫性分布；(2)在400倍视野下，避开出血和坏死区域，选取具有代表性的肿瘤区域，随机选择10个视野，计数500～1 000个细胞，计算每个病例的肿瘤细胞阳性率；(3)肿瘤细胞阳性率评分：<1%为0分；1%～<10%为1分；10%～<50%为2分；50%～<75%为3分；≥75%为4分；(4)同时根据染色强度进行记分：无染色0分；淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；(5)最后根据肿瘤细胞阳性率和染色程度进行评分相加：0～3分为低表达，4～7分为高表达。

1.2.3TUNEL法检测淋巴细胞凋亡 切片脱蜡并经抗原修复及PBS洗涤后H2O2中孵育20 min，清洗后滴加50 μL末端脱氧核糖酸转移酶(TdT)反应液常温孵育1 h，洗涤后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)遮光孵育25 min，DAB显色苏木素复染封片，阴性对照以PBS代替TdT。

1.2.4流式细胞术检测淋巴细胞凋亡 分别收集5例健康和胶质瘤Ⅳ级患者的抗凝新鲜外周血，梯度离心提取单个核细胞后经尼龙毛获得T淋巴细胞。经过聚羟基脂肪酸酯(PHA)活化的T细胞接种于24孔板，每孔500 μL×106个/mL，培养24 h后分为空白组(加入PBS)、拮抗组(抗PD-1+ PD-L1)和实验组(加PD-L1)共培养48 h，收集T细胞，经异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin V-FITC)避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

2 结 果

2.1免疫组织化学检测PD-L1在胶质瘤组织中蛋白表达 结果显示：PD-L1主要定位在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜，呈棕黄色着色PD-L1在人正常胶质细胞不表达，在部分胶质瘤中阳性表达42.50%(34/80)，见图1。

A:正常神经胶质细胞不表达PD-L1;B:胶质瘤低表达PD-L1;C:胶质瘤高表达PD-L1

图1免疫组织化学检测PD-L1在正常胶质细胞、胶质瘤组织的低表达及高表达(×200)

2.2PD-L1与胶质瘤临床病理因素之间的相关性分析 实验对胶质瘤PD-L1的表达与肿瘤位置、大小、有无坏死及临床病理分期及年龄等进行相关性分析，结果显示，病理分级越高，PD-L1的表达水平越高(P<0.01)；PD-L1表达与和胶质瘤分级相关的坏死有关，而与患者的年龄、性别、肿瘤位置、大小无关，见表1、2。

表1 PD-L1在80例胶质瘤组织中的表达与临床病理特征(n)

表2 80例胶质瘤患者在不同影响因素下PD-L1表达可信区间分析

2.3PD-L1的表达与患者的预后关系 按照材料与方法中的分类说明，将PD-L1在胶质瘤中的表达分为低表达组(评分0～3分)和高表达组(评分4～7分)。进行Kaplan-Meier生存分析发现：PD-L1低表达组患者5年生存率明显高于PD-L1高表达组的患者(P<0.05)，见表3、图2。

表3 54例胶质瘤随访成功患者PD-L1表达5年生存率

图2 PD-L1在胶质瘤组织中Kaplan-Meier生存曲线分析结果

2.4胶质瘤局部浸润的淋巴细胞表达PD-1并出现凋亡 免疫组织化学染色显示胶质瘤Ⅳ级瘤组织内浸润的部分淋巴细胞表达PD-1。TUNEL法检测结果显示PD-L1强阳性的病例中胶质瘤组织内浸润的淋巴细胞出现凋亡，然而PD-L1阴性的胶质瘤病例瘤组织内淋巴细胞凋亡数少，见图3。

图3 免疫组织化学检测胶质瘤Ⅳ级局部浸润淋巴细胞出现凋亡(TUNEL×200)

图4 PD-L1对外周血活化T细胞凋亡的影响

2.5PD-L1对患者外周血活化T细胞凋亡的影响 流式细胞结果显示重组人PD-L1与健康或胶质瘤患者外周血活化的T细胞共培养后，重组人PD-L1组的凋亡率为42.55%，明显高于空白对照组，加入抗PD-1阻断PD-L1与T淋巴细胞结合后，PD-L1+抗PD-1组T淋巴细胞凋亡率下降至26.80%，见图4。

3 讨 论

恶性胶质瘤患者复发率高、预后较差，迄今为止，胶质瘤局部微环境调节其侵袭性、增殖、凋亡等生物学异常行为的具体分子机制仍不清楚[4]。因此，阐明恶性胶质瘤细胞凋亡发生的分子机制，对胶质瘤的治疗及其预后有着重要的意义。

研究发现PD-L1可以独立作为胰腺癌患者预后评价的指标；同时在胃癌患者，高表达PD-L1患者临床分期晚，病理分化差[5-6]，PD-L1高表达病例其肿瘤扩散指数ki-67表达也上调，肿瘤细胞培养中运用阻断剂下调PD-L1后肿瘤细胞的转移与复发也程相对静止状态[7-8]。在非小细胞肺癌中，PD-L1在肿瘤细胞及肿瘤间质与淋巴细胞表达成正相关，也与临床分期及预后呈正相关[9]。这都提示阻断PD-L1可能是肿瘤免疫治疗的有效手段。本研究检测了80例胶质瘤石蜡切片中PD-L1的表达，结果发现胶质瘤各级别之间PD-L1的表达差异有统计学意义(P<0.05)，PD-L1的表达随胶质瘤级别的增高而增高，进一步的随访显示胶质瘤高表达PD-L1的患者5年生存率较低[10-11]。

在机体的免疫应答过程中，T细胞是适应性免疫的生发中心。T细胞在静息状态下低表达PD-1，而T细胞的激活引起PD-1的表达上调。本研究表明胶质瘤中浸润性淋巴细胞部分表达PD-1，同时TNUEL实验结果显示高表达PD-L1组胶质瘤内浸润性淋巴细胞凋亡明显，流式细胞结果也显示PD-L1+抗PD-1组T细胞的凋亡率明显下降，PD-L1蛋白促进胶质瘤外周血活化T细胞的凋亡，这提示了胶质瘤高表达的PD-L1与淋巴细胞表达的PD-1结合促进淋巴细胞的凋亡，进而抑制抗肿瘤免疫功能。这可能与T细胞跨膜受体PD-1与配体PD-L1结合后，其碳端结构域磷酸化继而去磷酸化其下游因子磷脂酰3激酶和脾酪氨酸激酶，进而抑制T细胞活化，诱导T细胞凋亡[12-13]有关。

综上所述，人胶质瘤组织异常高表达PD-L1，且与病理分级和患者预后密切相关，PD-L1与PD-1结合促进肿瘤内浸润的T淋巴细胞的凋亡，因此PD-1/ PD-L1信号通路有望成为胶质瘤免疫治疗的靶点之一。

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