热休克转录因子2通过促进白细胞介素-10的表达对肺癌发生的影响*

范敏娟,钟云华,沈 雯△,袁开芬,赵国厚,王蜀昆,温林俏

(1.昆明医科大学第二附属医院呼吸科，昆明 650101；2.云南省第一人民医院干疗科，昆明 650101)

肺癌发病机制较复杂，涉及多种细胞因子的改变，白细胞介素-10(IL-10)是一种重要的炎性细胞因子，主要来源于单核巨噬细胞和各种T细胞亚群，研究表明，随着肺癌分期越晚，IL-10的表达水平越高[1]，IL-10水平可预示肺癌病情的严重性。研究证实热休克转录因子1(HSF1)与肿瘤的发生有关[2]，过表达HSF1可激活巨噬细胞IL-10基因的启动子诱导IL-10 mRNA的表达[3]。HSF2作为另一类转录因子，可以结合至热休克蛋白(HSP)90的启动子区域上调其表达[4]，而HSP90α在肺癌中高表达[5]。可见，HSF2与肺癌的发生有关。而且，在溃疡性结肠炎的研究中发现，HSF2既可直接启动炎性因子的表达，也可通过炎性反应相关信号通路来调节炎性因子的生成[6]。本研究通过检测肺癌组织和癌旁组织中HSF2、IL-10两种因子的mRNA、蛋白的表达情况，观察HSF2对IL-10表达的影响，探讨HSF2通过促进IL-10的表达对肺癌发生的影响。

1 材料与方法

1.1材料 IL-10、HSF2试剂盒(上海艾博抗生物有限公司)，组织总RNA提取试剂盒、引物、实时荧光定量PCR检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，A549细胞(中国科学院昆明细胞库)，罗氏siRNA转染试剂盒(广州聚研生物科技有限公司)，3%牛血清白蛋白、PVDF膜、蛋白酶抑制剂、DMEM培养基(上海维森特生物技术有限公司)，生物素化山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素、RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，DMEM培养基、封闭用山羊血清、苏木精-伊红(HE)(北京索莱宝科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1标本来源及分组 标本从昆明医科大学第二附属医院及云南省第一人民医院获取。在手术获取肿瘤组织的同时，从距离肿瘤组织大于6 cm的组织中获取相应癌旁组织作为对照组，各获取标本50例。癌旁组织经过组织学分析确认没有肿瘤细胞浸润。所有患者术前均未经过任何治疗，取材时将所取组织用预冷的DEPC处理后的双蒸水冲洗两遍后，置于液氮中冷冻保存备用。标本的采集均征得患者本人及其家属的同意并签署手术同意书。

1.2.2RT-PCR检测mRNA 使用组织总RNA提取试剂盒提取组织RNA，第一链cDNA合成采用cDNA合成试剂盒。HSF2 RT-PCR引物，如下：正向引物5′-AAG TTC AGG CAG TGA TGG CA-3；反向引物5′-TGC ACA GAA CTA GTG AAA AGA TCA-3′。IL-10 RT-PCR引物，如下：正向引物5′-ACA TCA AGG CGC ATG TGA AC-3′；反向引物5′-TAG AGT CGC CAC CCT GAT GT-3′。RT-PCR以GAPDH为内参，其引物序列如下：正向引物5′-GAA GGT CGG AGT CAACGG AT-3′；反向引物5′-GAG GGA TCT CGC TCC TGG AAG-3′。PCR条件如下：预变性95 ℃ 1 min；变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 20 s，循环45次。荧光数据用Opticon Monitor软件进行分析。

图1 免疫组织化学检测肺癌组织及癌旁组织中HSF2、IL-10的表达(200×)

1.2.3Western blot检测蛋白质 肺癌及癌旁组织在匀浆后用RIPA裂解液进行裂解，裂解液中包含蛋白酶抑制剂。取50 μg蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳，电转移至PVDF膜上。电泳条件为80 V 15～20 min，待样品进入分离胶后120 V电泳40～60 min。电转移条件为200 mA 1 h。转移后的PVDF膜用3%牛血清白蛋白封闭1 h，一抗(1∶1 000)室温孵育过夜，洗涤后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗孵育1 h，洗涤显影。

1.2.4免疫组织化学检测组织蛋白质 病理标本取材后，经10%中性甲醛固定、组织脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片，接着进行HE染色和免疫组织化学染色，标志物为HSF2和IL-10，光学显微镜下观察免疫组织化学检测结果。抗体表达于细胞膜、细胞质或细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。每例切片阳性细胞数占同类细胞数的10%以上者视为阳性，于200×镜下拍照。

1.2.5细胞培养和转染 培养基为10%胎牛血清的DMEM培养基。将细胞培养于含有5% CO2的37 °C培养箱中。待细胞成对数期生长时转移于6孔板中，每孔细胞数约2×105个，细胞生长至60%～80%视野时，开始转染试验。以Lipofectamine 2000为载体，具体操作步骤按照Invitrogen公司提供的实验方案。

2 结 果

2.1HSF2在肺癌组织中表达上调 比较50例肺癌组织和其癌旁组织，RT-PCR检测发现，癌组织中HSF2 mRNA的表达明显高于癌旁组织，占比为76%(38/50)(P<0.01)。Western blot和免疫组织化学检测发现，癌组织中HSF2蛋白水平也明显上调，蛋白水平和mRNA水平一致，见图1、2。

2.2IL-10在肺癌组织中表达上调 比较50例肺癌组织和其癌旁组织，RT-PCR检测发现，癌组织中IL-10 mRNA的表达明显高于癌旁组织，占比为80%(40/50)(P<0.01)。Western blot和免疫组织化学检测发现，癌组织中IL-10蛋白水平也明显上调，蛋白水平和mRNA水平一致，见图1、3。

A：RT-PCR检测HSF2的mRNA水平；B:Western blot检测HSF2的蛋白水平

图2肺癌组织及癌旁组织中HSF2的表达

A：RT-PCR检测IL-10的mRNA水平；B：Western blot检测IL-10的蛋白水平

图3肺癌组织及癌旁组织中IL-10的表达

2.4肺癌组织中IL-10的表达上调与HSF2的表达上调呈正相关 对肺癌组织的IL-10与HSF2的表达进行相关分析，发现IL-10的表达上调和HSF2的表达上调呈线性正相关(R2=0.9216)，见图4。

图4 肺癌组织中HSF2与 IL-10表达的相关分析

2.5siRNA干扰HSF2降低A549 中IL-10表达 在A549细胞中，以siRNA干扰HSF2的表达，Western blot检测发现，A549表达siRNA后，HSF2和IL-10的表达均明显降低，见图5。

图5 siRNA干扰HSF2后IL-10的表达

3 讨 论

肺癌对人类健康危害极大，细胞微环境的改变可以促进肿瘤的发生[7]。在细胞微环境的改变中，热休克反应是以基因表达变化为特征的一种防御适应反应，研究表明，HSF在肿瘤的发生发展中扮演了重要角色。本研究发现HSF2在肺癌组织中高表达，表明HSF2与肺癌的发生有关。HSF2被认为主要与机体的发育有关，近年来的研究发现肿瘤的发生和胚胎发育的早期有着非常多的相似性[8]，因此，肺癌中HSF2的表达上调也就显得较合理。

在肿瘤的发生过程中，另一个微环境的改变就是促炎性和抗炎性细胞因子比例的改变。IL-10作为一种抗炎性细胞因子，在肿瘤的发病中具有重要作用，既可直接影响肿瘤细胞和间接抑制免疫细胞而有利于肿瘤生长，还可通过抑制肿瘤定居的巨噬细胞来抑制血管生成。在哺乳动物体内，IL-10和自身受体结合可以磷酸化Janus激酶1(JAK1)和酪氨酸激酶2(TYK2)，进而激活信号传导及转录激活因子3(STAT3)。活化的STAT3通过激活淋巴细胞活化信号分子(SLAM)、小异源二聚体基因1(SHP-1)和细胞因子信号传导抑制蛋白3(SOCS3)等介导IL-10的生物学功能[9-10]。IL-10可以抑制辅助性T细胞1(Th1)细胞的生成和增殖，还可以抑制巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)的功能，使肿瘤得以逃逸而进一步发展。随着肿瘤发展，IL-10的水平又会进一步升高。

研究发现血清IL-10的表达水平与非小细胞肺癌的发生成正相关，血清IL-10的水平可预示肺癌的预后[11]，也可为肿瘤的复发提供依据[12]。当非小细胞肺癌患者的肿瘤切除后，血清IL-10水平会降低，认为肺癌组织本身可能促进了IL-10的生成，从而有利于肿瘤躲避机体的免疫监视，继而使肿瘤易于发展及转移[13]。梁晶[14]研究发现IL-10参与肺癌患者微环境的构成，是导致肺癌免疫功能抑制的原因之一，可作为监控晚期肺癌患者免疫功能的参考指标。本研究发现肺癌组织中IL-10高表达，进一步说明肺癌组织可以促进IL-10的生成。因此，在肺癌患者中进行IL-10的监测，可间接掌握肺癌患者的病情，便于及时调整治疗方案，IL-10的水平可作为肺癌病情严重性的生物标志物。

夏蜀娴等[15]研究发现，溃疡性结肠炎患者中HSF2的表达水平增加，HSF2可通过调控核因子-KB(NF-kB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中的家族成员，参与炎性细胞因子的转录调控，而多种炎性细胞因子又可激活NF-kB、MAPK通路，其之间关系较紧密。本研究对50例肺癌组织的HSF2和IL-10的表达水平进行了相关分析，发现二者的表达呈正相关，siRNA干扰HSF2可以降低A549 中IL-10的表达，进一步说明HSF2可以调节肺癌细胞IL-10的表达。HSF2促进IL-10的表达，可能有利于肺癌细胞躲避机体的免疫监视，进一步促进肿瘤的发生，但相关分子机制还有待深入研究。

综上所述，HSF2和IL-10在肺癌组织中表达上调，HSF2可促进IL-10的表达，可能有促于肺癌的发生、发展，而肺癌中HSF2是否可以直接结合到IL-10的启动子区域调控其表达还有待进一步的研究来揭示。

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