死亡结构域相关蛋白对卵巢癌细胞周期及化疗影响的研究

伦巍巍,王俊耐

(郑州大学第三附属医院妇产科 450015)

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，化疗耐药一直是卵巢癌治疗中的一大难题[1]，研究其耐药机制是解决这一难题的关键。死亡结构域相关蛋白(death domain associate protein，Daxx)于1997年在Cell杂志上首次以Fas死亡相关蛋白发表[2]，但其对细胞凋亡的影响一直备受争议[3-4]。有学者提出Daxx参与Fas凋亡通路的调控而发挥促细胞凋亡的作用；而有大量研究证明，在人的正常细胞或者结肠癌细胞中，Daxx通过抑制凋亡基因的转录而最终发挥抗细胞凋亡的作用[5]。已有研究表明Daxx基因在卵巢癌中普遍高表达[6]。本实验目的在于明确Daxx对卵巢癌化疗的影响，从而进一步明确其耐药机制。

1 材料与方法

1.1材料 化疗药多柔比星购自美国Sigma公司(货号CAS25316-40-9)，实验所用卵巢癌细胞株C13k购自ATCC细胞库。抗体cyclinB1及抗体cleaved-parp够自武汉三鹰生物技术有限公司(货号分别为55004-1-AP、13371-1-AP)，抗体Daxx及抗体actin购自博士德生物工程有限公司(货号分别为PB0580、BM0005)。流式细胞仪购自美国Thermo公司(型号ABI17500)。

1.2方法

1.2.1分组 卵巢癌耐药细胞C13k转染后分为阴性对照组(NC组)和下调Daxx组(siDaxx组)。

1.2.2流式仪对细胞周期的检测 C13k细胞用胰酶消化后接种于12孔板，接种第2天加化疗药多柔比星处理细胞。上述两组细胞药物浓度梯度均为0、0.15、0.30、0.60 μmol/L。培养基均为1.5 mL。药物作用24 h后，胰酶消化细胞，1 200 r/min离心5 min，细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗1遍，用70%冰乙醇固定细胞，于-20 ℃过夜。第2天从-20 ℃取出细胞，1 200 r/min离心5 min，再用预冷的PBS洗1遍，用10倍浓度的碘化丙啶(PI)及100倍浓度的RNA酶(RNAase)各300 μL避光染色细胞30 min，转流式管上机分析细胞周期变化。

1.2.3流式仪对细胞凋亡的检测 0、0.30 μmol/L的多柔比星处理上述两组细胞24 h后，胰酶消化两组细胞，800 r/min离心5 min，PBS轻柔漂洗1次，800 r/min离心5 min收集细胞；向收集管中加入 500 μL 结合缓冲液(Binding Buffer)，轻轻摇晃，使细胞悬浮；向每个收集管中加入5 μL的异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin V-FITC)，轻轻混匀，然后再加入5 μL PI，摇晃，使其充分混匀；于室温下避光放置，使细胞和上述试剂充分反应 5～15 min；避光，置于4 ℃，于1 h内进行流式细胞仪检测。

1.2.4Western blot C13k细胞接种于12孔板，第2天用0.30 μmol/L药物梯度处理细胞48 h后。胰酶消化细胞，1 500 r/min离心5 min，再用PBS洗涤细胞1次。用RIPA裂解细胞提取蛋白，30 μg上样量行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳。牛奶封闭1 h，封一抗cyclinB1、cleaved-parp及内参蛋白GAPDH，4 ℃过夜；第2天封抗兔及抗鼠二抗，TBST洗涤2 h后，曝光仪曝光。

2 结 果

2.1检测siRNA的干扰效应 向C13k细胞中转入siRNA后，在未经化疗药处理和经化疗药处理后的Daxx表达水平均明显降低，见图1。

2.2流式细胞仪检测两组细胞周期的变化 两组细胞的周期对比，在多柔比星0.30 μmol/L时，差异有统计学意义(P<0.05)，NC组和siDaxx组在不加药时，均阻滞于G1期；加多柔比星化疗药后，相比与NC组，siDaxx组的G2/M期细胞百分比明显增高，见表1。

图1 未加及加后，siRNA的干扰效应

表1 不同浓度的多柔比星作用下NC组及siDaxx组各细胞周期所占比例分析

图2 未加与加0.30 μmol/L化疗药处理后两组的细胞凋亡率比较

2.3流式细胞仪检测两组细胞的凋亡比较 不加药时两组凋亡率差异无统计学意义(P=0.122)，多柔比星(0.3 μmol/L)作用时NC组的凋亡率高于siDaxx组(P=0.031)，见图2。

2.4Western blot检测cyclinB1、cleaved-parp的表达 siDaxx组细胞在化疗药多柔比星作用后，cyclinB1表达水平降低，细胞阻滞于G2/M期，受损的细胞DAN发生损伤修复，细胞凋亡率降低；NC组受损伤的DNA跳过G2/M期检测位点，损伤没有得到修复，细胞凋亡率高，见图3。

图3 化疗药处理后cyclineB1及cleaved-parp在两组的表达

3 讨 论

很多化疗药发生耐药是由于肿瘤细胞DNA受损后，通过某些机制使细胞周期停滞，使受损的细胞DNA在停滞期得到有效的损伤修复[7]，从而使癌细胞逃过化疗致DNA损伤的杀伤作用。

Daxx作为一种保守的多功能蛋白，通过蛋白与蛋白的相互作用或者转录调控下游基因的表达，与肿瘤细胞凋亡关系密切[8-9]。有研究发现Daxx与p53结合后通过抑制p53对下游基因的转录调控作用，使周期相关蛋白(如p21、CDKs等)表达下调，受损的DAN不能修复而使细胞发生凋亡[10]；在人结肠癌细胞、肝癌细胞中，Daxx通过转录调控有丝分裂检测位点的表达，参与癌细胞凋亡[11];在卵巢癌中，过表达Daxx能够促进卵巢癌的进展，使癌细胞发生化疗耐药，这一机制可能与Daxx转录调控相关周期蛋白表达，使细胞周期停滞、损伤的DNA得以修复，从而使癌细胞逃过化疗的杀伤产生耐药有关[12]。本实验中，在卵巢癌耐药细胞株C13k中，利用siRNA降低Daxx蛋白的表达后，能使C13k细胞对多柔比星发生化疗耐药。进一步对这一现象的机制进行探讨，笔者发现在0.30 μmol/L的多柔比星作用时，siDaxx组细胞中G2/M期调控蛋白cyclineB1表达水平下降，使C13k细胞在G2/M期发生周期阻滞，化疗药作用下损伤的DNA在这一时期得到有效的损伤修复，DNA损伤标志性蛋白cleaved-parp表达水平下降，从而对多柔比星的耐药性增加，而这一现象与之前的研究[12]相反。在本实验中，增加多柔比星的药物浓度至0.60 μmol/L时，siDaxx组的G2/M期的阻滞作用消失，G1期细胞增加，细胞周期有继续进展的趋势。

Daxx作为一种多功能蛋白参与转录调控及Fas信号通路促进细胞凋亡，并作为细胞核蛋白参与染色体的稳定作用等[13-15]。本实验中在卵巢癌耐药细胞系C13k细胞中下调Daxx表达后，细胞对多柔比星的耐药性增加。寻找使Daxx表达上调的方式，可能使耐药细胞株C13k对多柔比星化疗增敏，这为卵巢癌化疗耐药的机制研究及临床治疗提供了一个新的靶点。

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