抗病毒蛋白Viperin抑制猪瘟病毒在PK-15细胞上的复制

李文良，毛 立，邓加武，郝 飞，李基棕，杨蕾蕾，张纹纹，江杰元

(江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京 210014)

Ⅰ型干扰素与特异受体结合后诱导产生的干扰素刺激基因(interferon stimulate genes, ISGs)是先天免疫系统的重要组成成分和效应分子，在机体抵抗感染过程中发挥重要作用。Viperin(virus inhibitory protein，endoplasmic reticulum-associated，interferon-inducible)是一种ISG编码的抗病毒蛋白，最早于2001年由K. C. Chin等鉴定并报道[1]。Viperin在正常细胞中的基础表达水平很低，但可以被Ⅰ型干扰素、脂多糖(LPS)、poly(I:C)以及多种病毒诱导产生，且Viperin的表达可以通过干扰素依赖和非依赖的两种途径实现[2-3]。研究证明它对不同病毒科的多种病毒具有抗病毒活性，如单纯疱疹病毒[4]、H1N1流感病毒[5]、乙型肝炎病毒[6]、狂犬病病毒[7]、人副流感病毒3型[8]等，近年有报道证明马源Viperin对马传贫病毒[9]、猴源和猪源Viperin对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)[10-11]具有抑制作用。

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的高度接触性传染病，CSFV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，基因组为单股正链RNA，长约12.3 kb。该病是危害养猪业发展的重要病毒性疾病，是OIE规定的必须报告的疫病，我国目前依靠高强度的疫苗免疫等综合防控策略控制该病[12]。深入研究CSFV与宿主细胞的相互作用具有重要意义。已有研究发现猪Mx1蛋白、鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)能够显著降低CSFV在细胞和猪体内的增殖水平[13-14]。

为了探讨猪源Viperin对CSFV复制的作用，本研究在稳定表达Viperin的PK-15细胞系上研究Viperin对CSFV复制的抑制作用，并研究其发挥作用的机制，丰富了Viperin抗病毒谱，为猪瘟与Viperin相互作用研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

RNA提取试剂TransZol UP、一步法荧光定量RT-PCR检测试剂盒、Taq酶、预染蛋白质Marker、HRP标记羊抗小鼠/兔IgG(H+L)、DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；ECL化学发光显色试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司；WH303抗体购自AHVLA；FITC/Cy3标记的羊抗小鼠IgG购自武汉博士德生物技术公司；flag/HA标签单抗、兔抗flag/HA标签多抗、Alexa Fluor 555标记的驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG、DAPI、Western及IP细胞裂解液、Protein G Agarose、免疫染色固定液及封闭液购自碧云天生物技术研究所。

猪瘟病毒石门株购自中国兽医药品监察所。

PK-15、293T细胞由本实验室保存。稳定表达Viperin的细胞系PK-Vi及对照细胞系PK-C1由本实验室构建[15]。

1.2 过表达Viperin对CSFV复制的影响

将PK-Vi及对照细胞系PK-C1铺于24孔细胞培养板，待细胞达到80%融合度时接种猪瘟石门株病毒(MOI=0.05)，在12、24、48、72 h后分别收获全细胞培养物、培养上清和细胞裂解物。通过荧光定量RT-PCR和TCID50检测不同样品中的病毒含量。

1.3 干扰Viperin表达对CSFV复制的影响

设计并合成针对Viperin的siRNA(siVi，5′-GGAAGAAGAUAUGACAGAATT-3′)及阴性对照siRNA(siNC，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。使用Lipofectamine 2000，按照说明书将siVi和siNC(50 nmol·L-1)分别转染PK-Vi细胞。12 h后收获细胞通过荧光定量RT-PCR和Western blot 检测Viperin表达的变化。同时接种CSFV，于48 h后收获细胞样品检测病毒含量变化。

1.4 荧光定量RT-PCR

使用Transzol UP试剂按照说明书提取样品中总RNA。采用相对定量RT-PCR检测样品中Viperin或CSFV基因表达水平，按照TransScript Green one-step qRT-PCR supermix说明书操作：总反应体系为20 μL，包含10 μL 2×Supermix、20 pmol·L-1的引物(表1，CSFV：qE2F和qE2R；Viperin：qViF和qViR；β-actin：actin qF和actin qR)、0.5 μL E-Mix、0.4 μL passive reference Dye、4 μL RNA。在ABI Step One荧光定量PCR仪上进行扩增反应：45 ℃反转录5 min；94 ℃变性30 s，然后按94 ℃5 s、60 ℃30 s进行40个循环。以β-actin为内参计算各处理组目的基因相对于阴性对照组的转录量变化并以-ΔΔCt表示。

表1PCR及荧光定量RT-PCR引物

Table1PrimersusedinPCRandqRT-PCR

引物名Primername序列SequenceVF25'-ATAAAGCTTCGCCACCATGTGGACACTGGTAC-3'VR25'-ATTCTCGAGTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACCAGTCCAGCTTCA-3'qE2F5'-GCTCCCTGGGTGGTCTAAGTC-3'qE2R5'-GGCTTCTGCTCACGTCGAA-3'qViF5'-AAGCAGAGCAGTTTGTTATCAGC-3'qViR5'-TTCCGCCCGTTTCTACAGT-3'actinqF5'-TCTGGCACCACACCTTCT-3'actinqR5'-TGATCTGGGTCATCTTCTCAC-3'

1.5 病毒滴度测定

将PK-15细胞接种96孔板，待长成单层后，用维持液将病毒样品做10倍倍比稀释后，接种细胞单层，每孔100 μL，做4个重复，37 ℃培养3 d。弃去细胞培养基，加入免疫染色固定液固定细胞15 min，然后加入封闭液孵育1 h。加入1∶200稀释的WH303抗体，37 ℃孵育1 h，洗涤后加入1∶200稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗涤后置荧光显微镜下观察每个稀释度出现荧光信号的阳性孔数。按Reed-Muench方法计算病毒TCID50。

1.6 激光共聚焦检测

试验1：将PK-Vi细胞接种于24孔板中的盖玻片培养24 h，待细胞达到80%融合度时接种CSFV，48 h后弃去细胞培养基，加入免疫染色固定液固定细胞15 min，然后加入封闭液孵育1 h。加入1∶200稀释WH303(针对E2蛋白)抗体，37 ℃孵育1 h，洗涤后加入1∶200稀释的Cy3标记的羊抗小鼠IgG，最后加入DAPI染色5 min，置于激光共聚焦显微镜(PE, Ultra View VOX)下观察，检测Viperin与感染病毒E2蛋白的定位情况。

试验2：合成CSFV的E2基因序列并在3′端引入flag标签，克隆入的真核表达质粒pCMV 中获得重组质粒pCMV-E2。通过PCR扩增(引物VF2、VR2，表1)在Viperin基因3′端引入HA标签，并克隆入pcDNA3.1中获得重组质粒pcDNA-Vi。质粒经酶切、测序验证，提取质粒并测定浓度。将293T细胞接种于24孔板中的盖玻片培养24 h，待细胞长满单层后进行质粒转染，24 h后弃去细胞培养基，加入免疫染色固定液固定细胞15 min，然后加入封闭液孵育1 h。加入1∶1 000稀释的flag抗体37 ℃孵育1 h，洗涤后加入1∶500稀释的Alexa Fluor 555标记的驴抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min；之后加入1∶1 000稀释的HA抗体37 ℃孵育1 h，洗涤后加入1∶500稀释的Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min。最后加入DAPI染色5 min，置于激光共聚焦显微镜(PE, Ultra View VOX)下观察，检测Viperin与E2蛋白的定位情况。

1.7 免疫共沉淀

将293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞长满单层后进行pCMV-E2和pcDNA-Vi质粒转染。48 h后弃去细胞培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入细胞裂解液裂解细胞，细胞样品经10 000 r·min-1离心10 min后加入1 μg HA抗体4 ℃孵育过夜，之后加入30 μL Protein G Agarose，4 ℃缓慢摇动孵育3 h。离心弃去上清，使用细胞裂解液洗涤3次，加入PBS重悬沉淀并加入加样缓冲液煮沸10 min后进行SDS-PAGE，转印后分别使用flag和HA抗体进行Western blot检测。

1.8 统计分析

荧光定量RT-PCR及病毒滴度测定试验均进行三次重复，各组数据经SPSS v.16软件分析其差异性(*.P<0.05；**.P<0.01)。

2 结 果

2.1 Viperin过表达对猪瘟病毒复制的影响

在PK-Vi和PK-C1细胞上分别接种CSFV后，收获全细胞裂解物通过荧光定量RT-PCR检测病毒含量。如图1所示，与PK-C1组相比，除12 h外，PK-Vi组的病毒基因组相对含量在24、48、72 h时均显著(P<0.05或P<0.01)下降，分别降低68.75%、83.61%和77.27%(图1A)。病毒滴度检测也显示相似的结果，在24、48、72 h时分别降低68.75%、87.5%和80.39%(图1B)。

*.P<0.05；**.P<0.01图1 过表达Viperin抑制CSFV的复制Fig.1 Over-expression of Viperin inhibits CSFV replication in PK-Vi cell line

2.2 RNA干扰Viperin表达对病毒复制的影响

为进一步证实Viperin作用的特异性，通过RNAi技术将siRNA转染PK-Vi及PK-C1细胞，进而检测CSFV含量的差异。如图2所示，特异的siVi转染后Viperin mRNA和蛋白质表达水平均显著(P<0.05)下降，而siNC转染细胞Viperin表达水平与未转染细胞一致；siVi与siNC转染的PK-C1细胞中Viperin含量均无显著变化(图2A、B)。接种病毒48 h后检测发现siVi转染的PK-Vi中病毒基因组含量和病毒滴度均显著(P<0.05)升高，虽然仍低于对照细胞。而转染前后的PK-C1细胞中病毒含量均无显著差异(图2C、D)。

2.3 Viperin表达对CSFV释放的影响

如图3所示，通过检测CSFV感染后24、48、72 h细胞培养上清和细胞沉淀中的病毒含量，发现其均同等程度地受到抑制，降低的比例之间没有显著差异，说明Viperin的过表达对病毒的释放没有影响。

2.4 Viperin与E2蛋白相互作用

将CSFV感染的PK-Vi细胞固定后加入针对E2蛋白的单抗WH303及荧光二抗孵育后进行共聚焦检测，发现二者存在共定位(图4A，黑白图中未能显示颜色)。进而通过构建E2与Viperin的真核表达质粒共转染293T细胞，固定后进行共聚焦检测，E2蛋白的红色荧光能够与Viperin的绿色荧光重合显示橙黄色，说明两种蛋白存在共定位(图4B，黑白图中未能显示本来颜色)。免疫共沉淀试验显示E2蛋白能够与Viperin相互作用(图5)。

A.qRT-PCR检测Viperin mRNA水平的变化；B. Western blot检测Viperin蛋白水平的变化；C. 病毒基因含量的检测；D. 病毒滴度(TCID50)的检测；*. P<0.05A.Viperin mRNA expression levels detected by real-time qRT-PCR; B. Viperin protein expression levels; C. CSFV genome copy numbers detected by qRT-PCR; D. Viral load (TCID50) detected by virus titration; *. P<0.05图2 抑制Viperin表达对CSFV复制的影响Fig.2 Knockdown ofViperin in PK-Vi cells impaired its antiviral activity

*.P<0.05；**.P<0.01图3 Viperin表达对CSFV释放的影响Fig.3 The effect of Viperin over-expression on the release of CSFV in PK-15 cells

A.Viperin在CSFV感染PK-15细胞中与E2蛋白共定位(100×)；B. Viperin在转染的293T细胞中与E2蛋白共定位(400×)A.Viperin co-localized with E2 in CSFV infected PK-15 cells (100×); B. Viperin co-localized with E2 protein in transfected 293T cells (400×)图4 共聚焦检测Viperin蛋白与CSFV E2蛋白的共定位情况Fig.4 Confocal microscopy examination of Viperin with CSFV E2 protein

图5 免疫共沉淀试验检测Viperin蛋白与E2蛋白之间的相互作用Fig.5 The interaction between Viperin and E2 protein in transfected 293T cells by co-IP assay

3 讨 论

CSFV感染能够引起免疫抑制和细胞凋亡，并且形成了独特的干扰宿主免疫反应的机制。研究证实其Npro蛋白能够与IRF3相互作用，诱导IRF3经蛋白酶体途径降解，从而发挥抑制靶细胞IFN-α和IFN-β产生的作用[16]。另有报道糖蛋白Erns对IFN-β启动子具有抑制作用，同时对NDV诱导的IFN-β产生具有抑制作用[17]。深入研究CSFV与宿主先天免疫反应的相互作用对于CSFV致病机制及防控技术研究具有重要意义。已有报道证明人源MxA、猪源Mx1蛋白能够显著降低CSFV在细胞和猪体内的增殖水平[13-14,18]。Viperin作为一种抗病毒蛋白，对多种病毒具有抑制作用，尤其是黄病毒科黄病毒属的成员，如日本脑炎病毒[19]、西尼罗病毒(WNV)[20]、登革病毒(DENV)[20-21]、蜱传脑炎病毒[22]以及寨卡病毒[23]。

本研究利用前期试验构建的稳定表达Viperin的PK-15细胞系，研究Viperin对CSFV复制的抑制作用。通过检测接种病毒后不同时间病毒基因水平与滴度的差异证实Viperin的抗CSFV作用，在感染48 h抑制作用最强。在该细胞系上进一步转染特异的siRNA干扰Viperin的表达，CSFV的复制水平得到显著恢复，虽然与对照组相比仍有一定差异。这可能是由于siRNA的转染效率偏低导致Viperin的表达没有被完全抑制所致(从图2A、B中可以看出)。但是，这仍能够证明Viperin可以特异性抑制CSFV复制的结论。

与其他ISG不同的是，Viperin抗病毒没有统一的机制，对于不同病毒其发挥作用的机制不尽相同。Viperin包含N端双亲α螺旋结构区、SAM区和C端三个功能区，N端结构域是Viperin细胞定位的关键，对流感病毒[24]的抑制发挥关键作用；SAM区具有radical SAM酶活性[25]，在蜱传脑炎病毒[16]起作用；C端是Viperin最为保守的区域，在对DENV 2型[21]、HCV[26]作用中发挥关键作用。Viperin对HCMV可能是通过影响病毒复制晚期的成熟和组装发挥作用[1]。Viperin对流感病毒的抑制是通过影响脂筏结构，抑制病毒的出芽释放发挥作用的[24]。Viperin对呼吸道合胞病毒的抑制作用是发生在病毒复制的后期[27]。本研究在证明Viperin在基因组水平及病毒滴度水平抑制CSFV复制后，参考流感病毒的研究方法，通过检测细胞培养上清和细胞内病毒含量，发现其均同等程度地受到抑制，从而证明Viperin不影响病毒的组装释放。此外，通过激光共聚焦和免疫共沉淀检测发现Viperin与病毒E2蛋白存在共定位，两种蛋白质间存在相互作用，E2蛋白是病毒重要的结构蛋白，是囊膜的组成成分，推测Viperin有可能通过与E2蛋白(但不排除还有其他病毒蛋白，如非结构蛋白中的NS3、NS5B、NS5A等)相互作用影响蛋白质的加工、转运或病毒的组装来发挥抑制病毒的作用。

4 结 论

本研究证实Viperin具有抗CSFV作用，该作用可能是通过与病毒E2蛋白相互作用实现。本研究丰富了Viperin的抗病毒谱，为猪瘟与Viperin及其与宿主免疫反应相互作用的研究提供了理论基础。

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