矮紫堇化学成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析*

★ 魏春华曾金祥 史亚夫 罗光明 高燕萍 钟国跃 朱继孝*

(1.江西中医药大学中药资源与民族药研究中心 南昌 330004； 2.江西中医药大学药学院 南昌 330004)

矮紫堇(CorydalishendersoniiHemsl)也称尼泊尔黄堇，藏药名桑格丝哇，是罂粟科紫堇属植物矮紫堇和扁柄黄堇的干燥全草，作为传统藏药“日棍”，具有活血散瘀、利气止痛功效，藏医用于治疗胃溃疡、胃炎、跌打损伤、坐骨神经痛、疥癖疮毒、毒蛇咬伤、刀伤等[1]。紫堇属植物含有多种生物碱成分，药理学研究发现其具有抗菌、镇痛、抗炎、抗心律失常、保肝等活性，并且对心血管系统、中枢神经系统、平滑肌等有药理作用[2]。在藏区广泛地应用于临床。本课题组前期研究采用经典的解热镇痛抗炎动物模型，综合评价了矮紫堇在解热镇痛抗炎方面的药理活性及作用机制，但矮紫堇化学成分方面的报道较少，其药效物质基础研究仍然欠缺。近年来随着分析技术的发展，UHPLC-Q-TOF-MS 技术由于其分离速度快、灵敏度高、测定准确性强而被广泛运用于中药及复方的分析中[3-4]。本实验采用 UHPLC-Q-TOF-MS 技术对矮紫堇进行了分析研究，定性鉴定出10个生物碱类成分、2个黄酮类成分，为矮紫堇的质量控制与研究应用提供了可靠的方法，为藏药进一步的开发与应用提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-30A超高效液相色谱仪，PDA紫外检测器；Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪，配备 ESI 离子源及 Analyst 1.6 数据处理软件、PeakView数据处理软件(A美国B SCIEX 公司)；KQ-5200DB 型超声清洗机(昆山市超声波仪器公司)；AL204 型电子分析天平(Mettler Toledo 仪器(上海)有限公司)； Millipore-Simplicity 超纯水处理系统(德国默克密理博公司)。

1.2 试药 原阿片碱对照品(纯度≥98%，批号：MUST-16012408)、槲皮素对照品(纯度≥98%，批号：MUST-16031804)均购自成都曼思特生物科技公司；甲醇(HPLC 级，美国天地有限公司)；甲酸(HPLC 级，山西西亚化工有限公司)；水为Milli-Q 系统纯化水(美国Millipore 公司)。矮紫堇购自成都荷花池中药材市场，经江西中医药大学中药资源与民族药研究中心钟国跃研究员鉴定为罂粟科植物矮紫堇(C.hendersoniiHemsl)的干燥全草。

2 方法

2.1 供试品溶液制备 矮紫堇粉碎，称取约2.0 g置于50 mL锥形瓶，加入25 mL 75% 甲醇超声提取45min，抽滤、旋干、定容至5mL容量瓶中，取定容后药液过0.22μm 微孔滤膜过滤，供UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2 标准品溶液的制备 分别精密称取2mg对照品(原阿片碱、槲皮素)于5 mL容量瓶中，用75%甲醇溶解稀释至刻度，过0.22 μm微孔滤膜，待分析。

2.3 LC-MS 条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱：YMC-ULtraHT Pro C18色谱柱(100 mm×3 mm，2μm)；流动相：0.5%甲酸水溶液(A)，甲醇(B)，梯度洗脱：0～5min，10% ～ 18% B；5～35 min，18% ～50% B；35～55 min，50～ 95% B；55～57min，95%～10% B；57～62min，10%～10% B；流速：0.4 mL/min；柱温：32℃；进样量：4μL。

2.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源(ESI)，负离子模式；质量扫描范围 m/z 100～1000；喷雾电压：-4500 V，雾化气温度：500 ℃，气帘气：140.745kPa，辅助气：344.74 kPa；去簇电压(DP)：100V；采用TOF-MS-IDA-MS/MS 方法采集数据，TOF/MS 一级预扫描和触发的二级扫描TOF/MS/MS 离子累积时间分别为200、100 ms，CE 碰撞能量为40eV，CES碰撞能量叠加为(40±10)eV。

2.4 数据处理 采用AB Sciex公司 Peak View 1.6软件，对UHPLC-Q-TOF-MS/MS采集的数据进行处理。

3 结果

3.1 矮紫堇化学成分分析 采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 对75%甲醇提取矮紫堇药材成分进行定性分析，(+) ESI-MS 的质谱总离子流图(TIC)(图1)。(-) ESI-MS 的质谱总离子流图(TIC)(图2)。应用Peak View 1.6软件分析75% 甲醇提取无尾果中各化学成分的保留时间及其质谱信息，并结合分子离子峰与对照品、相关文献报道数据进行对比，对其中的化学成分进行推断，初步推断出矮紫堇提取物中生物碱类化合物10个，黄酮类成分2个。

图1 矮紫堇提取物在正离子模式下总离子流图

图2 矮紫堇提取物在负离子模式下总离子流图

3.2 化合物的质谱裂解特征 化合物1 tR为10.99min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z356.1856[M+H]+，其分子式为C21H25NO4，分子离子发生RDA裂解与B环开裂得到碎片离子m/z191.0854、165.0709，与文献裂解规律一致，推测此化合物为四氢巴马汀[5]。

化合物2 tR为11.20min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z342.1699[M+H]+，其分子式为C20H23NO4，分子离子发生RDA裂解得到碎片离子m/z178.0849、165.0717，B环开裂得到碎片离子m/z192.1017、151.0601，分子离子分别失去CH4、CH3OH得到碎片离子m/z326.1393、310.1436，与文献裂解规律一致，推测此化合物为四氢非洲防己碱[5]。

化合物3 tR为11.39min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z328.1543[M+H]+，其分子式为C19H21NO4，分子离子发生RDA裂解与B环开裂得到碎片离子m/z178.0863、151.0760，分子离子失去CH3OH得到碎片离子m/z296.1292，与文献裂解规律一致，推测此化合物为金黄紫堇碱[5]。

化合物4 tR为12.55min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z340.1542[M+H]+，其分子式为C20H21NO4，分子离子发生RDA裂解得到碎片离子m/z177.0612、165.0817，B环开裂得到碎片离子m/z192.1015、148.0763，分子离子失去CH2O得到碎片离子m/z309.1119，与文献裂解规律一致，推测此化合物为四氢小檗碱[5]。

表1 矮紫堇提取物的化学成分鉴定结果

化合物 5 tR为12.60min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z370.1649[M+H]+，其分子式为C21H23NO5，分子离子发生RDA裂解得到碎片离子m/z205.0648、163.0744，α裂解得到碎片离子m/z190.0861、181.0865，分子离子失去CH4及H2O得到碎片离子m/z337.1310，碎片离子m/z205.0648分别失去OH和H2O得到碎片离子m/z190.0861、188.0704，与文献裂解规律一致，推测此化合物为别隐品碱[5]。

化合物6 tR为13.81min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z354.1334[M+H]+，其分子式为C20H19NO5，分子离子发生RDA裂解得到碎片离子m/z206.0816、149.0600，α裂解得到碎片离子m/z189.0767、165.0558，碎片离子m/z206.0816分别失去OH和H2O得到碎片离子m/z189.0767、188.0703，与文献裂解规律一致，推测此化合物为原阿片碱[6]。

化合物7 tR为17.04min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z321.0987[M+H]+，其分子式为C19H14NO4，分子离子失去2个氢而形成稳定的大π共轭系统得到碎片离子m/z319.0800，分子离子失去CO和2个氢得到碎片离子m/z291.0847，碎片离子m/z291.0847失去CO得到碎片离子m/z263.0894，与文献裂解规律一致，推测此化合物为黄连碱[5]。

化合物8 tR为17.90min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z337.1268[M+H]+，其分子式为C20H18NO4，分子离子失去CH3得到碎片离子m/z322.1031，分子离子失去CO和2个氢得到碎片离子m/z307.0781，碎片离子m/z307.0781失去CO得到碎片离子m/z278.0763，与文献裂解规律一致，推测此化合物为小檗碱[5]。

化合物9 tR为18.12min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z334.1077[M+H]+，其分子式为C20H15NO4，分子离子失去CH3得到碎片离子m/z318.0762，分子离子失去1个氢得到碎片离子m/z332.0923，碎片离子m/z332.0923失去CO得到碎片离子m/z304.0974，与文献裂解规律一致，推测此化合物为二氢血根碱[5]。

化合物10 tR为33.78min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z301.0361[M-H]+，其分子式为C15H10O7，分子离子峰m/z301.0361分别失去CO、C7H6O2得到碎片离子m/z273.0427、178.9833，碎片离子m/z178.9833失去CO得到碎片离子m/z151.0057，推测此化合物为槲皮素，裂解规律与文献一致[7]。

化合物11 tR为38.73min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z301.0361[M-H]+，其分子式为C15H10O6，分子离子峰失去CO得到碎片离子m/z257.0466，碎片离子m/z257.0466失去CO得到碎片离子m/z229.0509。碎片离子m/z285.0421发生RDA裂解得到碎片离子m/z151.0052、133.0291，推测此化合物为木犀草素，裂解规律与文献一致[8]。

化合物12 tR为50.39min，正离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z390.1338[M+H]+，其分子式为C23H19NO5，分子离子失去8位的丙酮基形成相对较稳定的苯并菲啶类生物碱,得到碎片离子m/z332.0914，碎片离子m/z332.0914分别失去CH3和CO得到碎片离子m/z317.0676,304.0963，碎片离子m/z304.0963失去CO和2个氢得到碎片离子m/z274.0862，与文献裂解规律一致，推测此化合物为8-丙酮基二氢血根碱[5]。

图3 金黄紫堇碱(A)、小檗碱(B)和槲皮素(C)的质谱图谱

4 讨论

藏药资源丰富，但基础研究薄弱，很多单味藏药品种多停留在品种整理、资源调查或生药学鉴定阶段，紫堇属藏药的情况亦是如此。UHPLC-Q-TOF/MS 联用仪的优势在于: 一次进样，同时获得高质量的 TOF-MS和 TOF-MS/MS，通过精确相对分子质量，进行目标化合物的筛查和确证[9]。本试验采用液质联用技术，通过色谱分离、质谱鉴定共鉴别矮紫堇复杂提取物中的10种生物碱类成分，2个黄酮类成分，并初步了解了其质谱裂解规律。金黄紫堇碱、四氢非洲防己碱、四氢小檗碱、四氢巴马汀等属于四氢原小檗碱型生物碱，通过RDA裂解与B环开裂进行裂解；别隐品碱与原阿片碱属于普罗托品类生物碱，RDA裂解与α裂解反应以及由母核失去1分子H2O形成[M+H-18]+的碎片峰是这类生物碱显著的质谱裂解规律；8-丙酮基二氢血根碱与二氢血根碱属于二氢苯并菲啶类生物碱，这类生物碱会先失去8位或者7位的取代基形成相对较稳定的苯并菲啶类生物碱。黄连碱与小檗碱属于原小檗碱型生物碱，这类生物碱母核一般不会发生裂解，仅有小分子取代基的裂解与丢失在母核上如果存在邻二甲氧基，则此邻二甲氧基会先失去 1 分子甲基后再失去 1 个氢从而形成亚甲二氧基，亚甲二氧基会继续丢失1分子一氧化碳从而形成1个稳定的三元氧环。

本实验中鉴别出的矮紫堇化学成分与本实验室前期文献报道基本一致[10-11]，说明应用液质联用技术同样可快速、准确鉴别中药复杂成分。但同时可以看出，也有部分成分前期未见报道。如现代化学研究表明，异喹啉类生物碱是紫堇属植物其的要特征性成分[12]，但矮紫堇中暂未推断出该类成分。但从总离子流图可以发现矮紫中还有大量成分结构尚未解析。因此，不能据此推测矮紫堇中不存在异喹啉类生物碱成分，仍需继续进行研究以进一步阐明其它成分。

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