HPLC法测定柴芍安神解郁颗粒中芍药苷的含量*

★ 郭鸣李智勇李洁环 莫平莉 王洛临 陈雪婷

(1.广州中医药大学 广州 510405；2.广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院) 广州 510095; 3.广东省中医药研究开发重点实验室 广州 510095)

柴芍安神解郁颗粒是我院经多年临床实践研制而成的中药复方制剂，由醋柴胡、白芍、石菖蒲、酸枣仁、法半夏、郁金等10味药组成，具有疏肝理气、化痰祛瘀、安神定志的功效。方中白芍，苦、酸，微寒，是该处方中的君药。文献报道，白芍具有广泛的药理作用[1-3]，如镇痛、镇静、抗惊厥;抗心肌缺血、抗凝、抑制血小板聚集、改善血液流变学; 调节免疫力及抗高血糖等作用。另外，其水煎剂及醇提物还具有抗抑郁作用，芍药苷是其主要活性成分之一[4-5]。本研究参考了白芍药材及制剂中芍药苷含量测定方法的相关研究[6-10]，通过本实验研究建立HPLC法测定柴芍安神解郁颗粒中芍药苷的含量，为该制剂的质量控制提供方法依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1200系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；XS205 型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 试药 柴芍安神解郁颗粒样品3 批(规格: 每袋装8 g，批号:20170401、20170402、20170403，广东省第二中医院制剂室提供)；芍药苷(批号：110736 -201539，中国食品药品检定研究院)；乙腈(色谱纯，德国默克公司)；水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相∶乙腈-0.1%磷酸水溶液( 14 ∶86)， 流速: 1.0 mL/min，柱温: 25 ℃，检测波长: 230 nm，进样量: 10 μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000，芍药苷与其它组分分离度符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成120.96 μg/mL的对照品溶液(贮备液)。

2.2.2 供试品溶液 取本品内容物，研细成粉末，取约0.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加入甲醇50mL，精密称重，超声(功率250 W，频率40 kHz)处理30 min，取出，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 精密称取不含白芍的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，即得。

2.3 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录HPLC色谱图，芍药苷色谱峰的保留时间约为15.123min，阴性对照在芍药苷色谱峰的位置处无干扰峰，且分离度达到要求，见图1。

图1 各测定溶液的HPLC谱图

2.4 线性关系试验 分别精密吸取1,2,4,6,8,10 mL芍药苷对照品贮备液(120.96 μg/mL)至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别进样10μL，记录色谱图；得到峰面积(Y)与进样量(X)的关系为Y=1.4294X-36.7473，r=0.9999，表明芍药苷在0.12690～1.20960 μg 进样量范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取对照品溶液，按照2.1项下色谱条件，连续进样6 次。计算峰面积RSD为0.95%，表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批号样品(20170401) ，按照2.1项下色谱条件，分别在0，2，4，8，12，18h 依次进样，测定芍药苷峰面积。结果峰面积RSD为1.44%(n=6) ，表明供试品溶液在18h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批号样品( 20170401) 6份，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备样品溶液，测定峰面积。其RSD值为1.89%，表明该方法验重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取供试品粉末约0.25 g ( 批号:20170401，芍药苷含量为6.714mg/g) ，精密称定，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，精密一定量的对照品溶液，按供试品溶液制备法制备供试液，即得。进样10μL，记录峰面积，结果表明回收试验结果良好。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定 取3批次样品，按“2.2.2”项下方法制备供试液，依法进行测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 参考2015版《中国药典》一部白芍项下芍药苷的含量测定方法，选择本实验的检测波长为230 nm[7]。

3.2 色谱分离条件的选择 实验中比较了两个流动相组合条件下芍药苷的出峰情况，

即乙腈-水(14∶86)和流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)，结果后者分离效果好，且色谱峰形良好。并考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃柱温下测定芍药苷成分的方法适应性，结果芍药苷色谱峰在20 ℃、25 ℃柱温下的保留时间重现性基本一致，当柱温为30℃时色谱峰保留时间相应地缩短，且色谱峰形较差，故选择25 ℃为作为检测柱温。

3.3 提取方法的确定 本实验考察了回流法及超声提取法2种提取方法制备供试液，结果两种方法制备的供试品色谱峰面积值无明显差异，为方便操作，选用超声提取法。实验中还考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇等提取溶剂对提取效果的影响，结果采用甲醇提取得到的供试品溶液中芍药苷含量测得值均高于其他方法，因此选择甲醇为提取溶剂。还比较了超声15min，30min及45min的提取效率，结果30 min 和45 min的提取效率明显高于15 min，而30 min 和45 min之间无明显差异，故确定超声时间为30 min。

本实验采用HPLC法测定该制剂中的芍药苷的含量。经方法学考察，该方法分离度良好，重复性好，准确度高，简单易行，可用于柴芍安神解郁颗粒中芍药苷的含量测定，为该制剂质量标准的制定提供了实验依据。

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