内质网-线粒体结构偶联在糖尿病心肌缺血再灌注损伤中的作用研究进展

张琼霞，夏中元，苏娃婷，张元，雷少青

心血管疾病，尤其是心肌缺血性疾病是糖尿病患者死亡的主要原因。目前，心肌缺血性疾病的主要治疗方法是恢复缺血心肌的有效灌流。然而，心肌缺血再灌注损伤是不可忽视的问题。心肌缺血再灌注损伤（IRI）是指缺血心肌在恢复血液灌流后其缺血性损伤进一步加重的现象。研究显示，糖尿病患者不仅IRI发病率高于非糖尿病患者，且心肌缺血再灌注损伤程度较非糖尿病患者更为严重[1]。目前，糖尿病加重心肌缺血再灌注损伤的机制尚不明确。以下几种机制可能参与其中：内质网应激、线粒体自噬、钙信号传导异常及细胞凋亡、炎症反应、磷脂代谢障碍等。

内质网与线粒体在细胞内广泛分布，是维持细胞功能的重要细胞器。内质网参与糖原、脂质、碳水化合物与固醇类激素的合成与代谢；作为核糖体的附着支架合成膜蛋白及分泌蛋白[2]。内质网是细胞Ca2+库，对维持细胞内Ca2+平衡稳定发挥重要作用。线粒体是ATP生成的主要场所，同时伴随着活性氧（ROS）的产生。线粒体的功能还包括维持Ca2+稳定、参与脂质氧化及激素代谢等。正常状态下，内质网和线粒体共同完成细胞的生理功能；病理状态下，相互影响，共同介导疾病的发生发展。这种联系主要通过内质网-线粒体结构偶联（MAMs）平台实现[3]。20世纪70年代在电镜下观察到线粒体外膜与内质网膜存在紧密接触，随着电镜成像技术的发展，发现线粒体外膜与内质网膜间存在高度共定位，但彼此之间不融合，保持较稳定的膜间距，称为MAMs[4]。本文旨在综述MAMs在糖尿病心肌缺血再灌注损伤中的研究进展。

1 MAMs的结构基础

研究发现[3]，多种蛋白质在线粒体外膜与内质网膜间聚集，维持MAMs结构稳定。其中线粒体融合蛋白2（Mitofusin，Mfn2）是线粒体外膜上高度保守的GTP酶，在结构偶联处聚集。de Brito等[5]实验证实，Mfn2基因敲除后内质网-线粒体结构偶联处膜间隙变大，从内质网转运至线粒体的Ca2+减少，推测内质网上的Mfn2可与线粒体外膜上的Mfn1或Mfn2形成二聚体，连接内质网与线粒体。Gyorgy等[6]发现，分子伴侣葡萄糖调节蛋白75（GRP75）连接钙释放通道1，4，5三磷酸肌醇受体1（IP3R1）和线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（VDAC1）形成钙离子通道，并在内质网膜与线粒体外膜间形成物理连接。聚集于MAMs上的炎性小体（NLRP3）主要参与细胞的炎症反应。MAMs上前髓细胞性白血病蛋白（PML）、肿瘤抑制基因（PTEN）则可以启动线粒体凋亡途径。除以上蛋白外，MAMs上富集较多其它的蛋白质，调控内质网与线粒体生理功能。

2 MAMs相关功能与糖尿病心肌缺血再灌注损伤

2.1 MAMs与内质网应激参与糖尿病心肌缺血再灌注损伤 内质网具有极强的内稳态系统，但仍然有很多因素可导致其内稳态失衡，激发内质网应激（ERS）。内质网应激主要表现为蛋白质合成暂停、内质网应激蛋白表达和细胞凋亡等。ERS涉及多条信号传导通路，其中研究较多的三条信号传导通路为PERK、ATF6及IRE1[7]。ERS作为细胞保护性应对机制体系一旦遭到破坏，细胞将不能合成应有的蛋白质，亦不能发挥正常的生理功能，甚至会出现细胞凋亡。研究发现[8]，MAMs对ERS具有重要调控作用。生理状态下，位于MAMs上的Mfn2与PERK相结合，使其处于非活化状态。抑制Mfn2表达或使其基因沉默时，PERK持续活化，其蛋白磷酸化作用增强，活化下游的eIF2α，启动内质网应激。同时发现，在Mfn2基因敲除的小鼠心肌细胞中，内质网应激伴侣蛋白表达增强，说明Mfn2可调控内质网应激。

糖尿病心肌缺血再灌注是激发内质网应激的强烈刺激。实验发现[9]，糖尿病心肌缺血再灌注时Grp78（Glucoseregulated protein 78，葡萄糖调节激酶78）、CHOP及Caspase12等内质网应激蛋白表达增加，引起细胞凋亡；同时JNK及IRE1信号通路（ERS中的两条信号通路）被激活。内质网应激在未折叠蛋白反应阶段通过减少蛋白合成，促进错误折叠蛋白正确折叠或加速错误折叠蛋白降解而起到内源性的保护作用。研究发现[10]，敲除Mfn2基因可以减少心肌梗死面积，改善心肌收缩功能，对心肌缺血再灌注起到保护作用。但也有研究发现过表达Mfn2可减少细胞损伤，因此Mfn2对内质网应激的调控以及对糖尿病缺血再灌注心肌细胞其他生理功能的影响仍需进一步研究。

2.2 MAMs与线粒体自噬参与糖尿病心肌缺血再灌注损伤 自噬体形成并包绕降解线粒体的过程即线粒体自噬。正常情况下，线粒体外膜上的PINK1合成后转运至线粒体内膜被降解，使PINK1一直保持在较低水平。当线粒体受损时PINK1转运受阻，线粒体外膜上PINK1水平上调，增多的PINK1可磷酸化Parkin使其转运至线粒体外膜[11]。Parkin使线粒体外膜上多种蛋白泛素化，易于被P62识别，定位至前自噬体膜，最后被降解。

在糖尿病状态下，高血糖诱导的ROS会导致线粒体自噬功能紊乱，继而促使机体胰岛素抵抗的发生。适度的线粒体自噬是机体抵抗心肌IRI的重要机制，研究证实[12]，缺血前应用自噬增强剂雷帕霉素可以明显减轻1型糖尿病大鼠心肌IRI后心肌损伤程度，因此，适当的线粒体自噬水平可能是抑制糖尿病心肌IRI关键途径。Kubli等[13]证实，用Parkin -/-小鼠与野生型小鼠复制心肌梗死模型，发现Parkin-/-小鼠梗死心肌边缘区Parkin蛋白水平及线粒体自噬水平均显著低于野生型小鼠，同时伴有线粒体肿胀及聚集。与野生型小鼠相比，Parkin -/-小鼠存活率明显降低。离体实验表明，心肌细胞过表达Parkin可减轻缺氧介导的细胞损伤。该研究结果提示，Parkin介导的线粒体自噬途径对于缺血、缺氧后心肌损伤具有一定的保护作用。

研究证实[14]，Mfn2是PINK1/Parkin相互作用并且引导Parkin聚集在受损线粒体的关键蛋白。PINK1磷酸化Mfn2，从而促进Parkin介导的泛素化作用。抑制Mfn2在心肌细胞上的表达可明显抑制Parkin向线粒体的转位，并抑制线粒体的自噬。同时，实验发现[15]，糖尿病心肌缺血再灌注时，Mfn2的表达明显下调，抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，因此，Mfn2可通过上调线粒体自噬而对糖尿病心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。然而，大量研究表明[16]，过表达Mfn2会加重心肌缺血再灌注损伤，与上述结果矛盾，原因在于Mfn2具有多种功能。在糖尿病缺血再灌注时，除介导线粒体自噬作用外，还可导致线粒体Ca2+超载，促进线粒体mPTP通道开放，从而促进细胞凋亡，因此Mfn2的综合作用可能是加重糖尿病心肌缺血再灌注损伤。

2.3 MAMs与钙信号传导异常及细胞凋亡参与糖尿病心肌缺血再灌注损伤 钙信号是重要的细胞内离子信号，广泛参与基因的表达、调控，细胞的增殖、分化等过程。钙信号系统的紊乱与多种疾病相关，如高血压、心脏病、神经退行性疾病、肿瘤、糖尿病等。钙离子作为钙信号系统的离子信使，在胞内的浓度必须被精确地调控以达到信号传递的准确性。

内质网是细胞内最大的钙库，对维持细胞内Ca2+平衡稳定起到重要作用。定位于MAMs上的的多种蛋白质不仅构成内质网与线粒体之间的物理连接，同时对Ca2+信号的传导与调控具有重要作用。其中具有连接作用的Mfn2表达减少可导致内质网向线粒体的钙流减少；位于内质网膜上IP3R1与位于线粒体外膜上的VDAC1通过GRP75连接形成钙离子通道，直接促进线粒体钙流。

研究发现[17,18]，心肌缺血再灌注时位于MAMs上的IP3R1磷酸化增强，同时VDAC1的表达增加，促使内质网内大量的Ca2+通过IP3R1/GRP75/VDAC1通道进入线粒体，使得线粒体内的Ca2+浓度迅速上升，导致线粒体Ca2+超载，促进线粒体膜上的渗透性转换孔开放，线粒体肿胀破裂，释放细胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子-1等与细胞凋亡密切相关的因子，促使细胞凋亡。糖尿病则加重以上过程。研究发现[19]，减少内质网与线粒体之间的相互作用，从而降低IP3R1/GRP75/VDAC1介导的线粒体内Ca2+超载可明显减轻心肌缺血再灌注损伤。减少IP3R1的磷酸化，下调VDAC1的表达同样可以改善糖尿病心肌缺血再灌注损伤，起到心肌保护作用。因此，在生理状态下，内质网与线粒体通过MAMs相互协调，维持胞质与线粒体内Ca2+浓度平衡稳定；而在糖尿病心肌缺血再灌注的情况下，内质网与线粒体之间的联系异常增加，打破Ca2+平衡稳定状态，这可能是糖尿病心肌损伤加重的机制之一。

2.4 MAMs与炎症反应参与糖尿病心肌缺血再灌注损伤NLRP3炎性小体作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应中起到重要作用，在多种疾病中发挥关键作用。包括家族性周期性自身炎症反应、2型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔兹海默病及心肌缺血再灌注损伤等。因此，作为炎症反应的核心，NLRP3炎性小体可能为各种炎症性疾病的治疗靶点。研究发现[3]，NLRP3表达于线粒体外膜及内质网，并且与MAMs共定位。NLRP3可招募激活促炎症蛋白酶Caspase-1，活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18的前体，产生相应的成熟细胞因子。NLRP3的活化还能够诱导细胞的炎症坏死。ROS是NLRP3的重要激活剂，而内质网与线粒体又是ROS产生的重要场所。糖尿病心肌缺血再灌注过程中，产生大量的ROS，持续强烈激活NLRP3，过度活化Caspase-1，使得IL-1β和IL-18等炎症因子异常增加，促使心肌细胞凋亡及发生炎症性坏死。使用NLRP3抑制剂INF4E可以明显减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤，减小梗死面积，改善心功能[20]。因此，炎症反应可能为糖尿病心肌缺血再灌注损伤加重的另一机制。

2.5 MAMs与磷脂代谢异常参与糖尿病心肌缺血再灌注损伤大多数磷脂在内质网内合成，极少数在线粒体内合成。一般认为[21]，磷脂在线粒体与内质网之间的转运不依赖囊泡而是MAMs，并且其合成过程需要在内质网与线粒体之间转运多次。磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的合成所需要的酶，如磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2等分别位于线粒体外膜和内质网内及MAMs上。因此，MAMs为磷脂的合成提供了平台。

磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等是细胞内各种生物膜及细胞膜的重要组成成分。糖尿病心肌缺血再灌注时导致线粒体功能失调，产生大量的ROS。ROS一方面引起内质网应激，导致磷脂合成障碍；另一方面引起脂质过氧化[22]，即ROS与生物膜的磷脂、酶及膜受体等相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物，从而使细胞膜的流动性减弱，通透性增加，最终导致细胞结构改变和功能障碍，引起细胞凋亡或坏死，加重糖尿病心肌缺血再灌注损伤。但糖尿病心肌缺血再灌注对于磷脂合成过程中，其内质网与线粒体之间的转运如何影响，及对于其合成所需要酶如何影响仍待进一步的研究。

3 结语与展望

综上，内质网与线粒体是细胞内两大重要的细胞器，MAMs作为联系两者的物质基础，使两者在结构与功能上相互关联，维持细胞的正常运转。不同状态下，通过改变表达于MAMs上的蛋白或者信号传导通路可以加重或减轻细胞损伤。糖尿病心肌缺血再灌注损伤机制十分复杂，目前尚不清楚。但已有的研究证明内质网应激、线粒体自噬、钙信号传导异常及细胞凋亡、炎症反应、磷脂代谢障碍等均参与其中，且这些机制均与MAMs有关。通过调控MAMs上相关信号传导通路及相关蛋白的表达，可以改善糖尿病心肌缺血再灌注损伤，起到心肌保护作用。因此，MAMs有望成为糖尿病心肌缺血再灌注损伤治疗的关键靶点。随着研究的进一步深入，对于MAMs的结构与功能在糖尿病心肌缺血再灌注损伤机制中所起的作用将会有更全面的认识，为糖尿病心肌缺血再灌注损伤的治疗提供扎实的理论依据。

图1 MAMs参与糖尿病IRI有关信号通路示意图（红色箭头表示促进，黑线表示抑制）

[1] Buntaine AJ,Shah B,Lorin JD,et al. Revascularization Strategies in Patients with Diabetes Mellitus and Acute Coronary Syndrome[J].Curr Cardiol Rep,2016,18(8):79.

[2] Schwarz DS,Blower MD. The endoplasmic reticulum: structure,function and response to cellular signaling[J]. Cell Mol Life Sci,2016,73(1):79-94.

[3] van Vliet AR,Verfaillie T,Agostinis P. New functions of mitochondria associated membranes in cellular signaling[J]. Biochim Biophys Acta,2014,1843(10):2253-62.

[4] Ruby JR,Dyer RF,Skalko RG. Continuities between mitochondria and endoplasmic reticulum in the mammalian ovary[J]. Z Zellforsch Mikrosk Anat,1969,97(1):30-7.

[5] de Brito OM,Scorrano L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria[J]. Nature,2008,456(7222):605-10.

[6] Szabadkai G,Bianchi K,Varnai P,et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+channels[J]. J Cell Biol,2006,175(6):901-11.

[7] Tang JY,Jin P,He Q,et al. Naringenin ameliorates hypoxia/reoxygenation-induced endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis in H9c2 myocardial cells: involvement in ATF6, IRE1alpha and PERK signaling activation[J]. Mol Cell Biochem,2017,424(1-2):111-22.

[8] Ngoh GA,Papanicolaou KN,Walsh K. Loss of mitofusin 2 promotes endoplasmic reticulum stress[J]. J Biol Chem,2012,287(24):20321-32.[9] Shi Z,Fu F,Yu L,et al. Vasonatrin peptide attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic rats and underlying mechanisms[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2015,308(4):281-90.[10] Hall AR,Burke N,Dongworth RK,et al. Hearts deficient in both Mfn1 and Mfn2 are protected against acute myocardial infarction[J]. Cell Death Dis,2016,7:e2238.

[11] Narendra D,Tanaka A,Suen DF,et al. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy[J]. J Cell Biol,2008,183(5):795-803.

[12] Zhou B,Lei S,Xue R,et al. DJ-1 overexpression restores ischaemic post-conditioning-mediated cardioprotection in diabetic rats:role of autophagy.[J]. Clin Sci (Lond),2017,131 (11):1161-1178.

[13] Kubli DA,Cortez MQ,Moyzis AG,et al. PINK1 Is Dispensable for Mitochondrial Recruitment of Parkin and Activation of Mitophagy in Cardiac Myocytes[J]. PLoS One,2015,10(6):e130707.

[14] Chen Y,Dorn GN. PINK1-phosphorylated mitofusin 2 is a Parkin receptor for culling damaged mitochondria[J]. Science,2013,340(6131):471-475.

[15] Gao Q,Wang XM,Ye HW,et al. Changes in the expression of cardiac mitofusin-2 in different stages of diabetes in rats[J]. Mol Med Rep,2012,6(4):811-814.

[16] Ong SB,Subrayan S,Lim SY,et al. Inhibiting mitochondrial fission protects the heart against ischemia/reperfusion injury[J]. Circulation,2010,121(18):2012-2022.

[17] Gomez L,Thiebaut P,Paillard M,et al. The SR/ER-mitochondria calcium crosstalk is regulated by GSK3 beta during reperfusion injury[J]. Cell Death Differ,2016,23 (2):313-322.

[18] Li X,Wang H,Yao B,et al. lncRNA H19/miR-675 axis regulates cardiomyocyte apoptosis by targeting VDAC1 in diabetic cardiomyopathy[J]. Sci Rep,2016,6:36340.

[19] Paillard M,Tubbs E,Thiebaut P,et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury[J]. Circulation,2013,128(14):1555-65.

[20] Mastrocola R,Penna C,Tullio F,et al. Pharmacological Inhibition of NLRP3 Inflammasome Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury by Activation of RISK and Mitochondrial Pathways[J]. Oxi Med Cell Longev,2016,2016:5271251.

[21] Scot J. Stone, Malin C. Levin, Ping Zhou,et al. The Endoplasmic Reticulum Enzyme DGAT2 Is Found in Mitochondria-associated Membranes and Has a Mitochondrial Targeting Signal That Promotes Its Association with Mitochondria[J]. J Biol Chem,2009,284(8):5352-61.

[22] Newsholme P,Cruzat VF,Keane KN,et al. Molecular mechanisms of ROS production and oxidative stress in diabetes[J]. Biochem J,2016,473(24):4527-50.