LRP5基因与LRP6基因的交互作用及其与冠心病PCI预后研究

方翔，李长岭，孙勇

流行病学与循征医学资料证实，高脂血症是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑梗死、心肌梗死等独立而重要的危险因素，并与这些疾病的患病率和病死率密切相关[1]。近来发现多种基因变异与原发性高脂血症相关[2]。有研究表明低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）6基因的突变可致血浆低密度脂蛋白和三酰甘油增高[3-5]，高血压、糖尿病和骨质疏松的发生率增加，而LRP5基因与LRP6基因的交互作用与冠心病的发生存在关联性[6]。本研究选择2011年6月～2014年6月因冠心病行冠状动脉介入治疗术（PCI术）的患者为研究对象，研究LRP5基因与LRP6基因的交互作用与冠心病PCI术后预后的相关性。

1 资料和方法

1.1 研究对象 入选2011年6月～2014年6月于四川省达州市第二人民医院因冠心病行PCI治疗的患者600例（PCI组），对照组为同期行冠状动脉造影结果阴性的患者600例。所有PCI患者均通过冠状动脉造影确诊，存在一支或一支以上主要冠状动脉血管狭窄，管腔狭窄度≥75%，置入支架均为雷帕霉素药物涂层支架。排除标准：①既往PCI或冠状动脉旁路移植术史；②既往前壁心肌梗死或心功能不全患者；③患者存在管腔狭窄度≥75%的病变而不能进行PCI治疗，未行完全血运重建；④2型糖尿病；⑤肝肾功能不全患者；⑥缺血性或出血性脑血管疾病等疾病；⑦抑郁状态或抑郁症病史。所有参与人员均知情同意，并签署书面知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1一般项目及生化指标测定 入选患者空腹测量身高、体重，计算体质指数BMI（kg/m2）。测量卧位双上肢血压，取其平均值。详细询问患者的吸烟史及家族史并记录。空腹抽取静脉血3 ml，立即送检，采用全自动血液生化分析仪进行血糖、血脂、血肌酐、同型半胱氨酸和高敏C反应蛋白水平检测，所用生化试剂均由罗氏公司提供。

1.2.2 DNA分析 从HapMap数据库（http://www.hapmap.org）入选了与冠心病相关9个LRP6单核苷酸基因多态性和2个LRP5单核苷酸基因多态性，入选标准为最小等位基因频率＞0.10。LRP6单核苷酸基因多态性分别命名为SNP6-1（rs2160525），SNP6-2（rs2284396），SNP6-3（rs4477532），SNP6-4（rs2302685），SNP6-5（rs7305037），SNP6-6（rs12823243），SNP6-7（rs1181333），SNP6-8（rs11054731）和SNP6-9（rs17848270）；LRP5单核苷酸基因多态性命名为SNP5-1（rs41494349），SNP5-2（rs3736228）。采用QIAamp DNA 提取试剂盒从患者血液中提取基因组DNA（凯杰公司，瓦伦西亚，美国），TaqMan方法测定SNP基因型（应用生物系统公司，福斯特市，美国）。PCR反应的总体积为50 L，在PE7000 进行检测时所需反应条件为：93℃，预变性2 min；93℃，变性30 s；60.5℃退火1 min，72℃延伸30 s，循环40 次，在4℃下进行保存。

1.2.3 随访 对所有入组者进行随访1年，随访期间发生如下情况为阳性心血管事件：①急性心肌梗死；②冠状动脉造影证实的支架内再狭窄；③冠状动脉造影证实非干预血管进展至管腔狭窄度大于75%；④因心绞痛住院，心电图符合典型缺血性ST-T改变；⑤证实的心源性猝死。

1.3 统计分析 采用卡方检验评估相关性和哈迪-温伯格平衡定律。采用SNPlyze5.1pro版本软件包对连锁不平衡和单体型进行分析（包括置换检验）。采用最大期望算法对单倍型估计。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。并对LRP6和LRP5基因单核苷酸多态性和冠心病PCI术后心血管事件发生二阶偏最小二乘路径模型（PLS-PM模型）进行分析，PLS-PM模型属于迭代算法，第一步在测量模型中解决潜变量与显变量之间的关系，第二步在结构模型中估计潜变量之间的路径系数。采用SAS 5.0软件包对数据进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般项目及生化指标测定 两组患者空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血肌酐、高敏C反应蛋白和同型半胱氨酸比较差异均无统计学意义（P＞0.05），表1。

2.2 LRP6和LRP5与冠心病PCI术后心血管事件发生的相关性 通过Pearson相关分析，发现LRP6的3个SNPs（SNP6-1，SNP6-2，SNP6-7）与冠心病PCI术后心血管事件发生存在相关性，而且SNP6-7和心血管事件发生具有强相关性。LRP5的2个SNPs（SNP5-1，SNP5-2）与冠心病PCI术后心血管事件的发生无明显相关性，表2。

2.3 LRP5基因和LRP6基因的交互作用与冠心病PCI术后心血管事件的关联 PLS-PM模型分析显示，LRP5-LRP6路径系数在病例组和对照组的差异具有显著性（P＜0.05）。此外，采用PLSPM模型来检验两个基因之间的交互作用显示，LRP5基因和LRP6基因的交互作用与冠心病PCI术后心血管事件存在关联性，即LRP6基因和LRP5基因的两个路径系数在病例组和对照组的差异具有显著性（P＜0.05），表3～4。

3 讨论

冠心病是严重威胁居民健康的一类心脏疾患。随着基因组学研究的进展，尤其近年来精准医学概念的提出[7]，基因多态性与冠心病的发生密切相关，因其对冠心病的发生、进展和不同治疗手段的反应明显，因此寻找相关基因的多态性与冠心病预后事件间的关联意义重大。多数研究认为PCI仅在改善患者的血管狭窄状况、缓解心绞痛方面有明显疗效，而不能从根本上改善患者的疾病状态，而且PCI术后冠状动脉病变依然会有明显进展[8,9]。对于基因组的研究有望提供精准化治疗，从根本上改善预后。

表1 两组患者基线情况对比

表2 LRP6和LRP5与PCI术后心血管事件发生的相关性分析

表3 LRP6基因和LRP5基因的交互性

复杂疾病的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，它存在基因与基因、基因与环境之间交互作用，暗示了它们在致病效应上的协同性，这种协同性特征在易感人群中表现为它们的统计学关联性，即存在着高度的相关性或依赖性。LRP5基因与LRP6基因有71%的同源性，它们编码的两个蛋白属于Wnt配体的共同受体，在经典的信号通路中起重要作用。LRP5基因与LRP6基因编码的蛋白在动脉粥样硬化炎症发展过程当中起着重要作用，都是通过一定机制来导致血脂异常，进而构成冠心病发病的生物环节。

LRP5基因与LRP6基因属于低密度脂蛋白受体家族的成员，两者有同源性，其编码的两种蛋白均属于Wnt配体的共同受体，均在经典的Wnt信号转导通路中起重要作用[10,11]。LRP5基因突变可导致骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征或者人群中的高骨密度症，同时高脂饮食喂养的LRP5基因缺陷小鼠会导致血胆固醇过多和葡萄糖耐受性受损，而LRP6基因则是动脉粥样硬化的易感基因。既往研究表明LRP5基因与LRP6基因的交互作用与冠心病的发生存在相关性[12]，本研究也发现SNP6-1，SNP6-2，SNP6-7与冠心病PCI术后心血管事件发生存在相关性，且SNP6-7和心血管事件发生具有强相关性。LRP5的单核苷酸基因多态性与冠心病PCI术后心血管事件的发生无明显相关性，而LRP5基因和LRP6基因的交互作用与冠心病存在关联性。研究表明LRP6基因R611C可引起高脂血症[13]，本研究亦证实了LRP6基因多态性与冠心病PCI术后患者的心血管事件发生具有相关性。目前关于LRP6基因多态性的研究有一定的进展，但是LRP6基因多态性以及LRP5基因和LRP6基因的交互作用在冠心病PCI术后患者病理生理发生过程中的确切机制及地位还需进一步证实。

当前动脉粥样硬化的基因治疗方面的研究还主要在动物实验阶段。主要的研究方法是通过有治疗作用的目的基因转入患者相关器官或组织中，然后目的基因在体细胞内进行适度的表达，以期达到治疗或延缓动脉粥样硬化进展的目的。寻找新的治疗基因、更理想的基因载体、更安全有效的基因转移途径仍然是进一步研究的重点，而与其它传统或新兴的治疗手段的结合也将是基因治疗在临床应用的重要方式。LRP5基因和LRP6基因以及两基因的交互作用与冠心病、冠心病PCI术后心血管事件的发生存在相关性，有望成为冠心病基因治疗的靶基因。

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