急性心肌梗死患者血浆中microRNA-1、尿路上皮癌相关1基因的表达及临床意义

胡龙刚，安毅

急性心肌梗死是临床的急危重症，具有发病率高、病情凶险、预后差、死亡率高等特点[1]。早发现、早诊断，并采取积极有效的方案进行治疗，是改善患者预后减少死亡率的重要措施。报道显示[2]，约25%的急性心肌梗死患者发病早期无明显胸痛等典型临床症状，缺乏特异性心电图改变，实验室检查指标如肌酸激酶、肌钙蛋白也呈阴性，易造成漏诊或误诊，延误治疗的最佳时机。因此，寻找早期灵敏度高、特异性好的生物学标志物辅助诊断具有重要意义。micro RNA（miRNA）是长度为20～25nt的非编码单链小分子RNA，通过调控基因表达、蛋白质的翻译以及靶RNA的稳定性而参与机体的病理生理过程，miRNA-1（miR-1）是已知的可在心肌组织、骨骼肌组织中表达的miRNA[3,4]。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200nt、无编码蛋白质功能的RNA，介导了胚胎发育、恶性肿瘤及心血管疾病的发生、发展过程，尿路上皮癌相关1基因（UCA1）是一种发现于膀胱移行细胞癌的lncRNA，作为癌胚基因参与调控了乳腺癌等恶性肿瘤的发生、发展过程[5,6]。本研究通过检测发病不同阶段急性心肌梗死患者血浆中miR-1和UCA1水平，旨在探讨其在急性心肌梗死中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组 选择2015年3月～2016年12月于青岛大学附属心血管病医院心内科收治的急性心肌梗死患者67例纳入病例组，男性39例，女性28例，年龄39～76岁，平均（56.3±8.1）岁。纳入标准：①符合急性心肌梗死的诊断标准[7]：血清心肌标志物升高且至少伴有以下任一项临床指标：缺血症状；新发的缺血性心电图改变；心电图提示有病理性Q波；影像学检查表明有新发的局部室壁运动异常，或者新的心肌活性丧失；冠状动脉造影结果证实冠状动脉内有血栓；②患者发病后2 h内入院。排除标准：①心功能不全以及既往有心肌梗死病史；②肝、肾功能障碍者；③近期有手术史及重大创伤者；④瓣膜性疾病、急性脑血管疾病；⑤自身免疫性疾病、血液系统疾病；⑥合并其他可能影响本研究结果的疾病。并于同期随机选取50例健康体检者为对照组，男性29例，女性21例，年龄42～75岁，平均（54.6±9.2）岁。本研究得到医院伦理委员会的批准，研究对象及家属均在知情同意书上签字。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及设备 Takara公司提供的RT-PCR试剂盒、RNAisoTMPlus，Ambion公司提供的miScript Reverse Transcription Kit和mirVanaTMmiRNA Isolation Kit，上海吉凯基因化学技术有限公司提供的miR-1和UCA1引物序列，ABI公司提供的ABI PRISM 7900实时荧光定量PCR仪，Eppendorf公司提供的微量高速离心机。

1.2.2 标本采集 对照组入组后，急性心肌梗死患者入院后不同时段（入院后2 h、8 h、12 h、24 h、7 d、14 d）收集血液标本4 ml。将血液自然凝固，然后以2000 r/min的速度离心10 min，收取血浆并置于1.5 ml的EP管中，保存于-20℃环境下，留待检测。

1.2.3 提取总RNA及反转录 严格按照Trizol试剂盒上的要求提取血浆中的总RNA，采用PCR引物设计软件Primer Premier 5.0设计miR-1和UCA1引物序列，并严格按照试剂盒上的要求进行相关操作进行逆转录。miR-1上游引物序列：5’-GGGGTGGAATGTAAAGAA-3’，下游引物序列：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；UCA1上游引物序列：5’-ACGCTAACTGGCACCTTG TT-3’，下游引物序列：5’-TGGGGATTACT GGGGTAGGG-3’；U6上游引物序列：5’-GC TTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。建立20μl的RT混合反应体系：2μl浓度为2.5mmol/L的dNTP，0.3μg的total RNA，0.5μl浓度为1μmol/L的RT特异引物，2μl浓度为10U/μl的MMLV反转录酶，0.3μl浓度为40U/μl的RNA酶抑制剂，2μl的10×RT Buffer，加入无RNA酶的水至总体积为20μl，反应条件为10℃ 30 min，40℃ 40 min，85℃ 5 min。构建20μl的PCR反应体系：1μl的通用引物，1μl的目的引物，10μl的QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，1μl的模板CDAN，7μl的无DNA酶水，扩增的反应条件为：95℃ 3 min，连续40个PCR循环，循环条件为95℃ 15s，60℃ 20s，72℃ 20s，77℃ 20s。采用ABI 7000软件分析实验数据，样本表达量以qRT-PCR荧光信号中达到设定的阈值时经历的循环数（Ct值）为标准。每个样本均重复循环3次，miR-1、UCA1的相对表达水平采用2-△△Ct表示。

1.3 统计学分析 数据均采用SPSS 19.0软件录入及统计分析，计量资料采用均数±标准差（x ±s）表示，两组间均数的比较采用t检验，miR-1、UCA1的相关性采用Pearson相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆miR-1、UCA1水平比较 病例组患者血浆miR-1的水平高于对照组，血浆UCA1的水平低于对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05），表1。

2.2 不同时段急性心肌梗死患者血浆miR-1、UCA1水平变化 急性心肌梗死患者入院后，血浆miR-1水平先呈逐渐上升趋势，在24 h达到最高值，随后呈逐渐下降趋势，并且入院后2 h、14 d的血浆miR-1水平均高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；血浆UCA1水平先呈逐渐下降趋势，在24 h降到最低值，随后呈逐渐上升趋势，且入院后2 h、14 d时仍低于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05），图1。

表1 两组血浆miR-1、UCA1水平比较

图1 急性心肌梗死患者血浆miR-1、UCA1水平随入院时间的变化趋势

2.3 急性心肌梗死患者血浆miR-1与UCA1的相关性 经相关分析，急性心肌梗死患者血浆miR-1与UCA1水平呈负相关关系，r=-0.497（P＜0.05）；入院后2 h、8 h、12 h、24 h、7 d、14 d，血浆miR-1与UCA1水平均呈负相关关系（r=-0.498、-0.492、-0.531、-0.596、-0.422、-0.495，P均＜0.05）。

3 讨论

急性心肌梗死主要指冠状动脉发生急性阻塞或血流减少而导致心肌缺血、缺氧，甚至引发心肌坏死的心肌缺血性疾病，严重威胁患者健康和生命质量[8]。心电图和心肌血清酶谱检查是临床辅助诊断急性心肌梗死的常见手段。肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白等是辅助诊断常见的心肌血清酶谱，但研究表明[4,9]，肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶在发病早期灵敏度较低，可能延误对病情诊治，肌红蛋白无法区分心肌和骨骼肌的损伤，缺乏特异性。

miRNA是在抑制转录后基因的表达、促进靶向mRNA的降解过程中发挥负性调节功能的非编码RNA，能够介导细胞的增殖、分化以及凋亡等过程，研究显示，miR-21[10]、miR-133[11]、miR-208[12]等miRNA与心血管疾病的发生、发展紧密关联。Cheng等[13]结果表明，miRNA在急性心肌梗死发病早期即可发生改变，并且具有细胞特异性，可在血浆、尿液中稳定表达。miR-1是参与心肌缺血、心肌肥厚、心律失常等心血管系统病理过程的miRNA，Pan等[14]构建的大鼠心肌梗死模型发现，miR-1在大鼠心肌梗死后迅速表达，且能稳定存在超过24 h。有研究表明[9]，miR-1高表达于急性心肌梗死患者血清中，是反映急性心肌梗死损伤的重要标志物。Lnc RNAs与mRNA有相同的特点，即自身不编码蛋白质，研究发现[15]，Lnc RNAs可在心肌梗死患者心肌组织、血液等表达，而心脏特异性Lnc RNAs参与调控心肌重塑过程，作为心血管疾病相关的靶向分子及生物标志物有重要价值。UCA1是主要表达于卵巢癌[16]、乳腺癌[17]等恶性肿瘤组织的膀胱特异性Lnc RNAs，研究显示[18]，成人组织中UCA1仅在脾脏、心脏中表达，并在心脏中呈明显高表达，因此有望成为心脏的特异性标志物。

本研究通过检测急性心肌梗死患者血浆中miR-1、UCA1水平，旨在探讨其在急性心肌梗死中的作用。结果显示，急性心肌梗死患者血浆中miR-1呈高表达，且高于健康体检者，而UCA1呈低表达，低于健康体检者，提示miR-1、UCA1可能参与了急性心肌梗死的发病过程。进一步分析，急性心肌梗死患者血浆miR-1与UCA1水平呈负相关，不同时间点，也均呈负相关。有研究发现[19]，miR-1通过介导氧化而下调UCA1表达，急性心肌梗死发生后，miR-1表达水平升高可直接或间接与UCA1结合，进而抑制UCA1的表达而导致其水平下调，随后miR-1水平逐渐降低，UCA1可从损伤的心肌释放至血液中，导致UCA1水平逐渐上升。综上所述，miR-1、UCA1在急性心肌梗死患者发病后异常表达，并随时间的变化波动改变，可能参与了急性心肌梗死的发生、发展过程，联合检测可能作为临床辅助诊断急性心肌梗死的标志物。

[1] Shafiq A,Goyal A,Jones PG,et al. Serum Magnesium Levels and In-Hospital Mortality in Acute Myocardial Infarction[J]. J Am Coll Cardiol,2017,69(22):2771-2.

[2] 辛金海,姚春霞,丁敏,等. 急性心肌梗死早期诊断中血浆microRNAs的标准化检测及临床意义[J]. 现代中西医结合杂志,2017,26(9):974-6.

[3] Liu J,Sun F,Wang Y,et al. Suppression of microRNA-16 protects against acute myocardial infarction by reversing beta2-adrenergic receptor down-regulation in rats[J]. Oncotarget,2017,8(12):20122-32.

[4] 田志鹏,孟亮,杨帆,等. micro RNA-1对急性心肌梗死的早期诊断价值研究[J]. 中国现代医学杂志,2015,25(17):30-4.

[5] Zhang TH,Liang LZ,Liu XL,et al. Long non-coding RNA MALAT1 interacts with miR-124 and modulates tongue cancer growth by targeting JAG1[J]. Oncol Rep,2017,37(4):2087-94.

[6] Xu CG,Yang MF,Ren YQ,et al. Exosomes mediated transfer of lncRNA UCA1 results in increased tamoxifen resistance in breast cancer cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(20):4362-8.

[7] Thygesen K,Alpert JS,Jaffe AS,et al. Third universal definition of myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardiol,2012,60(16):1581-98.

[8] Shin HC,Jang JS,Jin HY,et al. Combined Use of Neutrophil to Lymphocyte Ratio and C-Reactive Protein Level to Predict Clinical Outcomes in Acute Myocardial Infarction Patients Undergoing Percutaneous Coronary Intervention[J]. Korean Circ J,2017,47(3):383-91.

[9] 周子健,崔秀平,冯可清,等. 血清miR-1检测在急性心肌梗死早期诊断中的临床意义[J].中国当代医药,2016,23(15):124-6.

[10] Sygitowicz G,Tomaniak M,Blaszczyk O,et al. Circulating microribonucleic acids miR-1, miR-21 and miR-208a in patients with symptomatic heart failure: Preliminary results[J]. Arch Cardiovasc Dis,2015,108(12):634-42.

[11] Ning B,Qi X,Li Y,et al. Biventricular pacing cardiac contractility modulation improves cardiac contractile function via upregulating SERCA2 and miR-133 in a rabbit model of congestive heart failure[J]. Cell Physiol Biochem,2014,33(5):1389-99.

[12] Huang Y,Li J. MicroRNA208 family in cardiovascular diseases:therapeutic implication and potential biomarker[J]. J Physiol Bioche m,2015,71(3):479-86.

[13] Cheng Y,Tan N,Yang J,et al. A translational study of circulating cellfree microRNA-1 in acute myocardial infarction[J]. Clin Sci(Lond),2010,119(2):87-95.

[14] Pan Z,Sun X,Ren J,et al. miR-1 exacerbates cardiac ischemiareperfusion injury in mouse models[J]. PloS One,2012,7(1):e50515.

[15] 张滨. 长链非编码RNA（UCA1）在急性心肌梗死患者血浆中变化水平的研究[D]. 吉林:吉林大学,2015.

[16] Yang Y,Jiang Y,Wan Y,et al. UCA1 functions as a competing endogenous RNA to suppress epithelial ovarian cancer metastasis[J].Tumour Biol,2016,37(8):10633-41.

[17] Liu H,Wang G,Yang L,et al. Knockdown of Long Non-Coding RNA UCA1 Increases the Tamoxifen Sensitivity of Breast CancerCells through Inhibition of Wnt/β-Catenin Pathway[J]. PLoS One,2016,11(12):e0168406.

[18] Liu Y,Zhou D,Li G,et al. Long non coding RNA-UCA1 contributes to cardiomyocyte apoptosis by suppression of p27 expression[J]. Cell Physiol Biochem,2015,35(5):1986-98.

[19] Wang T,Yuan J,Feng N,et al. Hsa-miR-1 downregulates long noncoding RNA urothelial cancer associated in bladder cancer[J].Tumour Biol,2014,35(10):10075-84.