黄芩素对阿霉素肾病大鼠肾小管上皮细胞PERK-CHOP凋亡通路的作用*

★ 周昕 李芸 杨俊 易铁钢 易无庸（深圳市中医院/广州中医药大学第四临床医学院肾病科广东 深圳 518033）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一类严重威胁人类健康的疾病，蛋白尿是CKD进展的重要危险因素，蛋白尿引起的肾小管损伤在肾脏疾病进展中扮演了重要角色［1］。蛋白尿导致的肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell，TEC）凋亡是肾小管萎缩进而走向小管间质纤维化的重要因素［2］。在各种凋亡通路中，内质网应激相关 PERK-CHOP（PKR-like endoplasmic reticulum kinase，C/EBP-homologous protein） 通 路 在 蛋 白尿肾小管损伤中起到了重要作用［3］。阿霉素肾病（adriamycin nephropathy，AN）动物模型是一种慢性持续性蛋白尿模型，对研究持续性蛋白尿诱导的肾小管损伤具有很好的价值［4-6］。有研究显示黄芩素对肾脏疾病有一定的保护作用［7-9］，但其是否通过调节PERK-CHOP凋亡通路起到肾小管保护作用尚未见报道，本研究拟从PERK-CHOP凋亡通路探讨黄芩素对蛋白尿肾小管损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 18只雄性Wistar大鼠，体重170～220 g，购自南方医科大学实验动物中心，实验期间自由饮水、摄食。

1.1.2 实验用药、试剂及主要仪器 阿霉素（Sigma Aldrich，St. Louis，MI，USA），黄芩素（南京崇原生物有限公司），p-PERK一抗（Cell signaling Tec，MA，USA），western blot浓度为1∶500，免疫组化浓度1∶100，CHOP一抗（Cell signaling Tec，MA，USA），western blot浓度为1∶1000，免疫组化浓度为 1∶100，二 抗（Cell signaling Tec，MA，USA），免疫组化试剂盒（Maixin-Bio，Fuzhou，China），TUNEL 检测试剂盒（Merck，Darmstadt，Germany），大鼠代谢笼（Tecniplast，Buguggiate，Italy），荧光显微镜（Nikon Corporation，Tokyo，Japan），垂直电泳仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），转膜仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），罗氏全自动生化分析仪。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作及干预 将18只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组（正常组，n=6）、阿霉素肾病组（模型组，n=6）和阿霉素肾病+黄芩素观察组（观察组，n=6），模型组和观察组一次性尾静脉注射阿霉素2.0 mg/kg诱导阿霉素肾病动物模型，正常组注射等量生理盐水。造模后第1d开始，观察组予黄芩素300mg/（kg·d）灌胃，正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃，共治疗12周。

1.2.2 标本采集与保存 黄芩素干预12周后，使用大鼠代谢笼收集各组大鼠24h尿液标本。血液和肾脏组织样本采集：10%水合氯醛按35mg/100g腹腔注射麻醉，沿腹正中线剖开腹腔，从腹腔静脉采集血液样本，离心后留取血清，摘除肾脏，切取一半左肾用10%福尔马林固定，经脱水，透明，石蜡包埋，切片4μm，行肾组织细胞凋亡检测（TUNEL试剂盒测定）及免疫组织化学染色（p-PERK及CHOP）。剩余肾组织分离皮髓质后冻存于-80℃冰箱，使用Western blot方法检测肾皮质中p-PERK和CHOP蛋白含量。

1.2.3 标本测定 使用罗氏全自动生化分析仪测定24h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清总蛋白、血肌酐、血尿素氮。使用TUNEL试剂盒检测肾组织细胞凋亡情况，计数方法：每个样本随机选取5个高倍镜下视野（HPF，40×物镜），每个视野计数TUNEL阳性TEC个数，计算其平均值。免疫组化方法检测肾组织中p-PERK和CHOP的表达分布，Western blot方法检测肾皮质组织中p-PERK及CHOP蛋白的含量，结果以β-actin作为内参进行比较，使用Bio-Rad全能成像仪（Bio-Rad Laboratories，California，USA）进行统计分析。

2 结果

2.1 各组大鼠24h尿总蛋白定量变化 第12周时，与正常组比较，模型组24h尿总蛋白定量明显升高，黄芩素干预12周后，观察组较模型组有明显降低（图1）。

图1 各组大鼠24h尿总蛋白定量变化图

2.2 各组大鼠血清白蛋白、总蛋白、血肌酐、血尿素氮变化 第12周时，与正常组比较，模型组血清白蛋白明显下降（图2a），血清总蛋白、血肌酐、血尿素氮变化无明显统计学意义（图2b，c，d）；观察组血清白蛋白较模型组明显升高（图2a），血清总蛋白、血肌酐、血尿素氮变化无统计学意义（图2b，c，d）。

图2 各组大鼠血清白蛋白、总蛋白、血肌酐、血尿素氮变化图

2.3 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况 第12周时，与正常组比较，模型组TUNEL阳性TEC数量明显增加，观察组较模型组明显减少（图3）。

图3 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况图

2.4 免疫组化染色显示 p-PERK和CHOP主要表达于肾小管，肾小球可少量表达（图4a）。Western blot结果显示肾皮质组织中，模型组p-PERK、CHOP较正常组明显增多，黄芩素治疗12周后p-PERK、CHOP明显下降（图4b，c，d）。

图4 各组大鼠免疫组化染色比较图

3 讨论

肾小管损伤在CKD进展中起到重要作用，持续大量蛋白尿可通过诱导TEC凋亡促进小管萎缩、间质纤维化的发展［10］。细胞凋亡是细胞在一定信号刺激下出现的自主性、程序性细胞死亡，PERK是定位于内质网膜上的一种跨膜蛋白，p-PERK为其活化状态，很多因素可导致内质网功能的内稳态失衡，形成内质网应激，早期可促进细胞存活，随着内质网应激的延长，PERK则通过诱导CHOP表达促进细胞凋亡［11］。

本研究结果显示AN进展至12周时，模型组24h尿蛋白定量明显增加，血清白蛋白明显降低，这表明动物模型已进入持续性大量蛋白尿期。该状态下，TEC细胞凋亡数量明显增加，Western blot结果显示PERK-CHOP通路显著活化，而免疫组化染色结果显示p-PERK、CHOP主要表达在TEC细胞中，肾小球中仅有少量表达，这表明PERK-CHOP凋亡通路可能参与了TEC细胞的凋亡进展。黄芩素治疗12周后，观察组24h尿蛋白定量显著降低，血清白蛋白明显升高，TEC凋亡数量减少，肾皮质组织中p-PERK和CHOP的蛋白含量也明显下降，表明黄芩素可能通过调节PERKCHOP凋亡通路起到保护AN肾小管损伤的作用，但其制尚需进一步研究。

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［8］Lee E K, Kim J M, Choi J, et al. Modulation of NF-κB and FOXOs by baicalein attenuates the radiation-induced inflammatory process in mouse kidney [J]. Free radical research, 2011, 45(5):507-517.

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