川芎嗪对过氧化氢诱导PC12细胞氧化应激的作用*

★ 林文新 马阮昕 冯真英（1.广州市皮肤病防治所 广州 510095；.中山大学附属第六医院药学部 广州 510655；.湛江市第二人民医院 广东 湛江 5400）

1 材料与方法

1.1 材料 PC12细胞（中国科学院广州生物医药与健康研究院提供）；DMEM培养基和胎牛血清（美国 Gibco公司）；川芎嗪（南京广润生物制品有限公司）；过氧化氢（重庆川东化工有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、一氧化氮（NO）试剂盒，均购买于南京建成生物工程公司。

1.2 细胞培养 PC12细胞用DMEM培养基（含10%胎牛血清），置于细胞培养箱（37℃、5%CO2）中培养，选取其对数生长期细胞进行下列实验操作。

1.3 实验分组及药物剂量设计 实验分组为：正常对照组、H2O2模型组（300μmol/L）、川芎嗪+H2O2（20nmol/L+300μmol/L）低剂量组、川芎嗪+ H2O2高剂量组（100nmol/L+300μmol/L）及阳性对照 Vit C + H2O2组（200mg/L+300 mol/L）。制备H2O2模型前，预先用不同浓度的川芎嗪处理川芎嗪+ H2O2低剂量组和高剂量组的PC12细胞，而阳性对照组加相应浓度的Vit C处理PC12细胞，孵育24h后，洗涤除去培养基后，再加入300μmol/L的H2O2孵育24h制备氧化损伤模型。即除正常对照组外，其余各组均加入相应浓度的H2O2和药物培养液，继续孵育24h后，检测各项实验指标。

1.4 MTT法检测各组细胞的存活率 PC12细胞在含10%胎牛血清的培养液中培养24h后，先加入不同浓度川芎嗪（10～1000nmol/L）继续培养1h，然后加入300μmol/L的H2O2孵育24h后，接着每孔加入20μL噻唑蓝（MTT，12mmol/L），37℃孵育4h，倒去上清液， 每孔加入二甲基亚砜（DMSO） 100μL，振荡 3min，30min内在960全自动酶标仪上测570nm处的吸光度值。另外，将1.3处理的PC12细胞孵育24h后，同样按照上述MTT的操作步骤加入相对应的干预药物和H2O2， 测量570nm处的吸光度值，计算细胞增殖百分率。

1.5 LDH活性的测定 PC12细胞处理同1.3，PC12细胞在10%胎牛血清的培养液中培养24 h后，加入不同浓度的川芎嗪（20nmol/L和100nmol/L）以及Vit C（200mg/L）继续培养24h，再加入终浓度为300μmol/L H2O2刺激细胞4h，收集细胞外液。加入50μL的1% SDS，然后收集细胞层的细胞内液，用日立7170生化自动分析仪测定细胞外液和细胞内液中的LDH活性，以培养液中LDH活性单位占培养液加细胞层中LDH总活性单位的百分比作为LDH释放的百分率。

1.6 MDA、SOD、NO的检测 PC12细胞处理同1.3，各组细胞给药时间结束后，收集各组培养基进行检测。以TBA法测定MDA含量；以黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量；以硝酸还原酶法测定NO含量。具体的检测步骤按各试剂盒产品说明书进行。

1.7 统计学处理方法 实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。实验结果以均数±标准差（）表示，采用ANVOA进行组间均数比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 川芎嗪对H2O2诱导PC12细胞的活力影响 从表1可知，与0nmol/L比较组比较，随着川芎嗪剂量的升高，PC12细胞的存活率显著增加（P＜0.01），但并不呈剂量依赖性，反而是逐渐降低；且1000nmol/L川芎嗪干预后，PC12细胞的存活率显著降低（P＜0.05）。因此本实验选择20nmol/L和100nmol/L的川芎嗪分别作为低剂量和高剂量进行实验。

从表2可知，与正常组比较，模型组的PC12细胞活力明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，川芎嗪+ H2O2低剂量、高剂量组，阳性对照Vit C + H2O2组中细胞活力皆显著提高（P＜0.01）。

表1 川芎嗪对PC12细胞的活力影响（，n=6）

表1 川芎嗪对PC12细胞的活力影响（，n=6）

注：与0nmol/L比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

0 50.0±6.5 10 96.6±4.1**50 85.4±1.9**100 80.7±2.8**200 75.3±3.4**500 51.2±1.6**1000 39.8±0.5*

表2 各组药物干预对PC12细胞的活力影响（，n=6）

表2 各组药物干预对PC12细胞的活力影响（，n=6）

注：与H2O2模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常对照组 98.0±4.5##H2O2模型对照组 54.3±5.1川芎嗪+ H2O2低剂量组 98.3±5.7##川芎嗪+ H2O2高剂量组 81.0±4.1##阳性对照 Vit C + H2O2组 95.3±3.4##

2.2 川芎嗪对H2O2诱导PC12细胞的LDH释放的百分率 从表3可知，与H2O2模型对照组比较，川芎嗪+ H2O2低、高剂量组和阳性对照 Vit C + H2O2组的LDH释放率均显著降低，提示这些组的PC12细胞的存活率显著增加（P＜0.01）。

表3 川芎嗪对PC12细胞的LDH释放的百分率（，n=6）

表3 川芎嗪对PC12细胞的LDH释放的百分率（，n=6）

注：与H2O2模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

分组 百分率/%正常对照组 63.6±8.4**H2O2模型对照组 85.8±2.7川芎嗪+ H2O2低剂量组 58.8±3.0**川芎嗪+ H2O2高剂量组 60.1±2.1**阳性对照 Vit C + H2O2组 64.4±1.4**

2.3 川芎嗪对PC12细胞的MDA、SOD、NO的影响 从表4可知，与空白对照组比较，模型组细胞MDA水平显著增加，SOD和NO含量显著减少（P＜0.01）。与模型组比较，川芎嗪+ H2O2低、高剂量组和阳性对照 Vit C + H2O2组的细胞MDA水平显著减少，SOD和NO含量显著增加（P＜0.05）。

表4 川芎嗪对PC12细胞的MDA、SOD、NO的影响（，n=6）

注：与模型组比较，#P＜0.05,，##P＜0.01。

3 讨论

川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎，始载于《神农本草经》，本品辛温行散，入血走气，上行头颠，下走血海。善活血行气，祛风止痛。治血瘀气滞诸痛，兼寒者最宜，被前人誉为“血中之气药”。川芎嗪作为中药川芎的有效成分，临床上主要用于治疗缺血性心脑血管疾病。另有研究表明，川芎嗪对中枢神经系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统均有不同程度的药理作用。而研究川芎嗪对神经方面的氧化应激的研究较少。因此，本研究就着重探讨川芎嗪对H2O2诱导PC12细胞的氧化应激的作用。

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物、植物和微生物等。它是生物体内清除自由基的首要物质，其在生物体内的水平高低是衰老与死亡的直观指标。本实验中H2O2诱导PC12细胞的SOD比正常对照组显著减少，说明模型细胞的自由基清除能力降低。而用川芎嗪干预后，SOD含量比模型细胞的显著增加，这说明了给药后可对抗因氧自由基对细胞造成的损害，减少氧化应激引起的自由基造成的细胞伤害。

本实验中H2O2诱导PC12细胞的MDA比正常对照组显著减少，而NO比正常对照组显著减少，说明模型细胞的氧化应激程度增强和细胞损伤明显。而用川芎嗪干预后，MDA含量比模型细胞的显著减少，而NO含量比模型细胞的显著增加，这说明了给药后有缓解氧化应激的作用，减少模型细胞的损伤。

综上所述，川芎嗪通过减少H2O2诱导PC12细胞损伤模型的MDA和LDH水平，增加SOD和NO水平，进而缓解该细胞模型的氧化应激，可见川芎嗪具有一定的抗氧化作用，这也为进一步考察它的作用机制和临床使用提供指导作用。

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