噬菌体对细菌感染的治疗作用及应用研究

唐 陶,陈冰冰,龙航宇,林瑞庆

(华南农业大学兽医学院,广东 广州 510642)

细菌性感染是最常见的感染性疾病,若未及时进行有效的治疗,很有可能造成机体死亡。目前,抗生素是人医与兽医临床上最重要和使用最为广泛的抗感染药物,解决了很多人类疾病和畜牧业生产中存在的问题。然而,抗生素在使用中存在着较多滥用的情况,带来了一系列的问题,如细菌产生耐药性、动物抗病力下降、免疫抑制、畜产品药物残留、环境污染等,从而影响人类安全、危害养殖业健康发展以及破坏生态环境等。因此,科学家们一直在寻找新的抗菌制剂,而噬菌体以其特异性强、毒副作用小等特点成为新的研究热点。

1　噬菌体的溶菌机制

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称,广泛分布于自然界,因其中一部分能引起宿主菌裂解,故被称之为噬菌体。能使宿主细菌裂解死亡的噬菌体称为烈性噬菌体;还有一些噬菌体感染细菌后,并不使细菌死亡,这种为温和噬菌体。烈性噬菌体溶菌机制主要有两种,一种主要是缺乏溶壁酶的小基因组噬菌体使用的方式,它会利用多肽在不同阶段抑制宿主菌的胞壁质合成酶从而抑制宿主菌细胞壁的合成;另一种主要利用的是穿孔素-内溶素系统,穿孔素在细胞膜上打孔,使得内溶素可跨过孔径接触细胞壁从而发挥溶解作用,这两种机制均能通过破坏宿主菌的细胞壁达到溶菌的目的[1]。烈性噬菌体在感染敏感菌后,可以在菌内进行指数型增殖,之后裂解宿主菌并释放子代噬菌体,继而再侵染其他细菌,因此烈性噬菌体又被称为毒性噬菌体。

2　噬菌体治疗细菌性疾病的优势和局限性

2.1优势 噬菌体最为突出的优点是它具有明确的抑菌谱,大多数噬菌体只会对特定种属病原菌起到杀伤作用,对其他细菌及生物细胞不会有伤害;噬菌体的作用机制与抗生素不同,对很多具有抗生素抗性的细菌仍能起到裂解作用[2];噬菌体具有指数增殖能力,理论上使用噬菌体治疗只需要一次给药;还有重要一点,噬菌体是宿主依赖性的,只在细菌感染部位发生作用,它会随着宿主菌的清除而死亡,不会残留在体内[3]。

2.2局限性 噬菌体的裂解谱窄,通常只作用于细菌的某个属、种,有的甚至只作用于某种下的几株菌[4];不同噬菌体制剂使用的最佳条件不相同,需要较长的时间对使用方案进行探索研究,而目前缺乏科学有效的方法评价噬菌体的治疗效果[5];噬菌体对于机体而言属于外来异物,具有抗原性,会刺激机体的免疫系统,不利于噬菌体在体内扩增从而发挥更好的治疗作用[6];噬菌体虽作用于细菌,理论上对机体无害,但它本质上是一种病毒,可能会释放一些毒力因子[6],还可能会出现突变对机体造成危害。

3　噬菌体治疗细菌感染的应用

3.1发现 噬菌体于20世纪20年代被发现,虽然对其作用机理还不了解,但东欧和前苏联在那时便已开始尝试用噬菌体对细菌性疾病进行治疗,实践结果初步证实,噬菌体能够有效治疗细菌性疾病[7]。

3.3发展 随着抗生素广泛、大量的应用,其弊端也日益显露,最引人关注的是抗生素耐药菌的产生,一些原来已经控制的疾病再次成为难题。在畜牧养殖方面,一些抗生素会影响疫苗的免疫效果,造成免疫失败,此外兽药残留问题也威胁着人类的身体健康与生存环境[8]。现如今人们越发重视食品安全,在很多国家和地区已在养殖过程中禁用某些抗生素,国际上“绿色贸易壁垒”正在逐渐兴起,这也极大影响了我国畜产品的出口创汇。

面对这样的挑战,科学家们开始尝试开发研制新型兽药抗生素的替代品,而噬菌体以其特异性强、毒副作用小等特点,在经历了半个世纪的淡忘后再一次引起人们的注意,这为防治畜牧生产中出现的耐药菌感染提供了一个新思路,有望成为理想的抗菌药和新型生物杀菌制剂[9]。

在1996年,传染性疾病的权威及诺贝尔奖获得者Lederberg博士在PNAS的评论中指出:因耐药菌出现,抗生素治疗不再像以前那样有效,应该重视噬菌体作为抗菌治疗生物制剂的研究。于1998年召开的两年一度的Ever-green噬菌体国际会议,第一次吸引了数家生物技术大公司的注意并派员参加。大会主办人Kutter博士指出:对于噬菌体用于治疗,人们存在着根深蒂固的偏见,然而现有大量的证据提示噬菌体确实是一个有效的治疗途径。在2004年美国的ASM会议也以“新的噬菌体生物学”为主题,这次大会又称为“噬菌体峰会”。2011年,英国牛津大学则召开了第一届牛津国际噬菌体大会。在我国,2014年江苏省农业科学院召开了第一届噬菌体国际学术研讨会,第二届于2016年在武汉召开,而第三届大会也正在筹备中。

前期的大量临床实践和实验结果表明噬菌体疗法安全有效。在畜牧业方面,科学家们也进行了大量的研究,主要有以下两个目的,一是降低细菌性传染病对动物健康和生产的影响;二是通过减少动物疾病从而控制人兽共患病。

大肠杆菌和沙门菌等病原体引起的细菌性疾病一直困扰着养猪业。Easwa-ran等以大肠杆菌Sw1作为宿主,从猪粪中分离出裂解性噬菌体EcSw,试验发现该噬菌体在4℃到37℃、pH值5到pH值9时都可以稳定存在,稳定性在pH值3和pH值11时仅分别降低6%和33%。再将使用了EcSw处理的大肠杆菌Sw1与未处理的大肠杆菌Sw1的生长曲线进行比较,发现EcSw可以显著抑制大肠杆菌Sw1的生长[10]。Albino等分离了属于波多病毒科的沙门菌噬菌体,其在体外试验中,107PFU/mL的噬菌体即可显著抑制(P＜0.05)沙门菌,在猪接种106CFU/mL的体内试验中,粪便中沙门菌检出率从93.3%(28/30)减少到56.6%(17/30)。这些结果表明,应用的噬菌体能够减少猪肠道内沙门菌的定居[11]。还有研究发现,虽然噬菌体和益生菌都能促进猪的生长,但在试验中噬菌体显示出更好的效果[12-13]。

随着养鸡业不断地发展,尤其是集约化饲养,鸡的大肠杆菌病和沙门菌病也在一些鸡场中不同程度发生。国外研究者Gohary等研究发现,将大肠杆菌噬菌体喷洒在鸡舍中可以降低鸡群发生大肠杆菌病的几率,肉鸡死亡率显著下降[14]。Kim等还将肠炎沙门菌噬菌体加入肉鸡饲料,发现可以促进肉鸡生长并降低宿主病原菌的数量从而降低肠炎沙门菌造成的死亡率,试验没有观察到消极影响[15]。与家畜相比,禽类具有短消化道以及肌胃特有的物理消化方式,这些特点可能使其体内的噬菌体活性不易受到影响,因此在应用方面更具优势[16]。

奶牛乳腺炎是现今奶牛养殖业中极易暴发的一种细菌感染性疾病,严重影响奶牛的产奶量和牛奶的品质和安全,是降低奶牛业经济效益的主要因素之一。能够引起奶牛乳腺炎的微生物种类众多,金黄色葡萄球菌是主要的病原。巴西研究者从来自65个不同农场的250个牛奶样本中随机选择了20株分离到的金黄色葡萄球菌进行试验,分别有60%、65%的分离株表现出氨苄青霉素、青霉素抗性。研究者从污水中分离出了10株肌尾噬菌体科的金黄色葡萄球菌烈性噬菌体,发现有8株噬菌体可以裂解至少95%的金黄色葡萄球菌分离菌。进一步研究发现,其中7株噬菌体在90℃高温时仍可保持105PFU/mL以上的病毒滴度[17]。韩国科学家也成功地从奶牛场附近的污水中分离出了一株针对金黄色葡萄球菌的裂性噬菌体,预期这株噬菌体将可以有效地用于预防和治疗由金黄色葡萄球菌感染引起的乳腺炎[18]。格鲁吉亚已经将噬菌体制成药剂用于临床乳腺炎病畜的治疗,而在我国还处于研发阶段。

在水产养殖方面,细菌性弧菌病严重危害多种淡水和海水养殖鱼类,我国南方养殖的鳗鲡和北方养殖的虹鳟都深受其害,溶藻弧菌是导致弧菌病的主要原因之一。在印度进行的一项研究发现了一种噬菌体的溶菌酶可以抑制溶藻弧菌生物膜的形成和细菌的增长,并可以有效地溶解其他30%的弧菌属细菌。通过进一步研究发现,这种噬菌体在不同的pH值下具有广泛宿主谱、较高的敏感性和热稳定性的特点,可见利用噬菌体来控制溶藻弧菌很有前景[9]。

此外,对一些公共卫生领域危害较大的细菌性感染,试验证明,噬菌体疗法也有着良好的治疗效果。如噬菌体可以有效抑制霍乱弧菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、碳青霉烯类鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、弯曲菌、幽门螺杆菌等细菌[18-26]。

3.4应用 近年来,与噬菌体相关的研究领域越发广泛,噬菌体在生物传感器、医药、食品保鲜、废水处理等方面都取得了一定的进展[27]。目前国外已经有噬菌体类杀菌剂获得生产上市的许可,美国食品药品监督管理局(FDA)2006年批准ListShieldTM噬菌体产品可作为食品添加剂,应用于即食食品和禽肉制品中控制单核细胞增生李斯特菌的污染,这是美国第一次批准将噬菌体作为食品添加剂;2007年,FDA又批准了另外1株李斯特菌的噬菌体可以作为添加剂添加到奶酪等其他食品中;2011年,FDA批准了EcoShieldTM产品可应用于肉制品中降低大肠杆菌O157:H7的污染。2013年由美国Intralytix公司研发的针对沙门菌的噬菌体制剂SalmoFreshTM被美国食品药品监督管理局(FDA)认定为公认安全级产品(Generally Regarded As Safe,GRAS),并获批准上市。在我国,2007年1月由征宇公司推出了治疗仔猪黄痢与白痢的“生物止痢王”,它的主要成分为蛭弧菌及混合噬菌体等,主要是通过消灭动物体内的大肠杆菌、沙门菌等有害菌达到防治仔猪黄白痢的目的。2017年3月中国南京菲吉乐科生物科技有限公司宣布,全球首款旨在防治虾早死综合征的噬菌体产品“乐虾”上市。噬菌体疗法治疗多重耐药的病原体很有前景,几个噬菌体产品正在申请专利和开发成商业生物防治剂[28-29]。随着分子生物学及噬菌体技术的发展,今后会出现越来越多用于控制的各个领域病原菌的噬菌体商品。

4　展望

在寻找抗生素良好替代品的过程中,科学家们发现噬菌体疗法为我们治疗细菌性疾病提供了新的思路。对于耐药菌感染,可以筛选其噬菌体从而进行治疗,也可以尝试将抗生素同噬菌体联合使用,增强疗效并部分减少抗生素的使用;利用噬菌体特异性强的特点,应用其携带药物可对细菌进行更精准的杀伤;还可利用基因工程技术对天然噬菌体进行基因改造,如时下热门的CRISPR/Cas基因编辑技术、单突变等,改变和增加宿主范围;此外,依照噬菌体的作用机制及其释放的裂解酶可以人工设计新的更加方便使用的药物和疫苗,合成既有良好杀菌或预防效果又不易使细菌产生抗性的新型化合物,从而迎接全球耐药菌感染不断攀升对畜牧业以及人类健康的挑战。

参考文献: