HPLC法测定抗痨散中芥子碱硫氰酸盐的含量

杜建红，钟元高，凃显琴，何德云

抗痨散是成都军区八一骨科医院生产的医院制剂，主要成分由炮姜、川贝母、芥子、姜半夏等组成，具有清热、滋阴、解毒、消核、化瘀等功效，临床主要用于骨结核的治疗。原《总后卫生部非标准制剂标准》主要采用薄层色谱法监测该品种质量，未规定对任何成分进行含量测定。根据抗痨散处方成分及临床应用，为了更好监测该制剂质量，通过查阅相关文献资料[1]，拟采用高效液相色谱（HPLC）法测定抗痨散中芥子碱硫氰酸盐的含量，并进行方法学研究，供同仁参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（型号：Waters 2695）；KQ5200E型超声波清洗器 （昆山超声仪器有限公司）；电子天平（型号：METILER AE240S ）。

1.2 药品试剂 芥子碱硫氰酸盐对照品（中国食品药品检定研究院；批号：111702-201303，纯度：95.1%）；色谱乙腈（Fisher公司）；甲醇分析纯（纯度≥95.5%，成都市科龙化工试剂厂）；磷酸二氢钾分析纯（含量≥99.5%，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为蒸馏水（自制）。抗痨散（成都军区八一骨科医院生产，批号：20160811、20160923、20161114）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备[1]取芥子碱硫氰酸盐对照品适量，精密称定，加流动相制成0.02 mg/ml的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备[1]取抗痨散约2 g，精密称定[1]，置 100 ml量瓶中，加甲醇 50 ml，超声处理（功率 200 w，频率 40 kHz）45 min，放冷至室温，用流动相定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液制备[2]按照处方制备未含芥子的阴性样品，按照“2.1.2”项方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：岛津inertsustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.08 mol/L 磷酸二氢钾溶液（12∶88）为流动相，检测波长为326 nm，柱温 30 ℃，进样量：20 μl。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 按照上述色谱条件，依次进样对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，记录色谱图（图1），芥子碱硫氰酸盐与相邻杂质峰分离度为2.1，符合药典符合规定（分离度应不低于1.5），阴性对照溶液在芥子碱硫氰酸盐出峰处未检测到峰，专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 取芥子碱硫氰酸盐对照品约20 mg，精密称定，置250 ml量瓶中，加流动相溶解，稀释，定容，作为对照品储备液。再精密量取对照品储备液适量，加流动相制成含芥子碱硫氰酸盐0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mg/ml的溶液，作为考察线性关系的对照品溶液。采用上述方法分别进样上述对照品溶液，记录色谱图。以峰面积（A）对进样浓度C（μg/ml）进行线性回归，得芥子碱硫氰酸盐线性方程为：A=6×107C-42276（n=5），r=0.9999。

2.3.3 精密度试验 精密量取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录主峰峰面积，重复进样5次，结果芥子碱硫氰酸盐峰面积的相对标准平均偏差（RSD）为0.57%（n=5），表明该方法精密度试验良好。

2.3.4 重复性试验 取批号为20160811抗痨散样品约2 g，精密称定，按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照色谱条件分别进样，记录色谱图及称样量，以外标法计算每份芥子碱硫氰酸盐含量，考察重复性试验，结果RSD分别为1.53%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批供试品（批号：20160811），按供试品溶液制备方法制备，室温放置， 在同 1 d 内第 0、2、4、8、12、16、20、24 h 按上述色谱条件依次进样，记录色谱图，以外标法计算芥子碱硫氰酸盐含量，结果RSD为0.84%（n=8），表明芥子碱硫氰酸盐在24 h内稳定。

图1 高效液相色谱图

2.3.6 加样回收率试验 取抗痨散样品（批号：20160811，已测含芥子碱硫氰酸盐为0.6034 mg/g）1 g各6份，分别置100 ml量瓶中，再分别加入“2.3.2”项下对照品储备液各 7.5 ml，按“2.1.2”项下方法制备回收率供试品溶液[2]，依法进样20 μl，记录色谱图及称样量，计算芥子碱硫氰酸盐回收率。从表1可见，芥子碱硫氰酸盐加样回收率良好。

表1 芥子碱硫氰酸盐回收率结果(n=6)

2.4 样品含量测定 取3批抗痨散（批号：20160811、20160923、20161114）各 2 g，精密称定，每批次平行处理2份，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依次进样供试品溶液与芥子碱硫氰酸盐对照品溶液，以外标法计算芥子碱硫氰酸盐含量，结果显示3批样品含量分别为0.60、0.58、0.60 mg/g。3 讨论

抗痨散原质量标准的检测方法过于简单，不能有效监控制剂质量，已不能满足最新药典要求。为了更加有效控制药品质量，确保患者用药安全，本研究参考《中国药典》2015年版一部，考察HPLC测定该品种中芥子碱硫氰酸盐含量的适用性。通过对该方法检测芥子碱硫氰酸盐的线性关系、精密度、重复性、回收率等重要方法学参数进行考察，结果表明，HPLC法测定本品时精密度、重复性、回收率均良好，且该方法操作简单、准确度高，故能作为测定本品主要成分芥子中芥子碱硫氰酸盐含量的测定方法，为建立质量控制标准提供参考依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京:中国医药科技出版社，2015:160-161.

[2] 马永贵，李自明，闵敏，等.高效液相色谱法测定多乐宝林片中盐酸可乐定的含量[J].医药导报.2010，29（4）：522-524.