2型糖尿病患者调节性T细胞的抑制功能

王 芬 朱红霞 高玉斌

(武汉市中心医院新洲院区内分泌科，湖北 武汉 430400)

众所周知，免疫因素在2型糖尿病(T2DM)发病过程中起到重要作用，T2DM患者常存在自身免疫系统的紊乱〔1〕。研究发现，T2DM患者体内，自身反应性T细胞可与胰岛素发生免疫反应，从而损害胰岛组织，促进病情发展〔2，3〕。外周组织中具有免疫抑制作用的调节性T细胞(Treg细胞)可以调控自身反应性T细胞的功能，防止其对自身组织器官，如胰岛组织产生损害。因此，Treg细胞在T2DM发病过程中起到重要作用，其功能受损与T2DM的发病密切相关〔4～6〕。动物实验证实，小鼠体内Treg细胞可以调控T细胞对胰岛细胞的自身反应性〔7～10〕。本研究旨在探讨T2DM患者和正常人外周血中Treg细胞的比例与功能的变化。

1 对象与方法

1.1对象 选择2016年2～9月在新洲医院内分泌科就诊的60例T2DM患者为研究对象，归为2型糖尿病组(T2DM组)，男35例，女25例，年龄42～76岁，平均(57.4±12.8)岁。另选择同期在院体检的20例健康人作为对照组，男11例，女9例，年龄40～75岁，平均(55.1±11.9)岁。所有研究对象研究前均未接受放射性治疗，化疗或其他的治疗。所有研究对象对本次研究知情同意并签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会批准同意。

1.2仪器与试剂 细胞培养基(含RPMI、10%FBS、55 mmol/L 2-mercaptoethanol、2 mmol/L L-glutamine、10 μg/ml gentamicin、10 μmol/L HEPES)。流式分析仪器购自BD公司。流式荧光抗体购自Ebioscience公司。

1.3方法

1.3.1提取外周血单个核细胞 取研究对象25 ml外周静脉血，采用Ficoll-Paque (Sigma，CA，USA)梯度离心。

1.3.2细胞分选 采用CD4+CD25+Foxp3+CD127-磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)分选调节性T细胞，采用CD4+CD25-磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)分选CD4+CD25-T细胞。流式细胞术检测纯度均在95%以上。

1.3.3流式细胞术分析样品的制备 将细胞重悬在200 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，按照1×106细胞标2 μl流式抗体。置4℃冰箱中避光孵育20 min，用1 ml PBS洗一次。先标表面分子，再核固定标转录因子Foxp3。取300 μl PBS上流式仪器分析。

1.3.4体外抑制实验 将CFSE标记(终浓度2 μmol/L)的CD4+CD25-T细胞与Treg细胞共培养5 d，共培养比例为1∶1或者1∶0，分析CD4+CD25-T细胞的增殖情况。抑制率计算公式：抑制率(%)=〔1-(有Treg共培养的增殖率/没有Treg共培养的增殖率)〕×100%。

1.4统计学分析 使用Graph Pad Prism5.0软件行t检验。

2 结 果

2.1两组外周血Treg细胞在淋巴细胞与CD4+T细胞中的比例 将表达CD4+CD25+Foxp3+CD127-定义为Treg细胞。T2DM组〔(0.62±0.09)%〕与对照组〔(0.65±0.10)%〕中Treg细胞在淋巴细胞中的比例差异无统计学意义(P>0.05)。T2DM组〔(1.76±0.23)%〕与对照组〔(1.81±0.27)%〕中Treg细胞在CD4+T细胞中的比例差异亦无统计学意义(P>0.05)。

2.2两组外周血Treg细胞中Foxp3表达强度比较 Treg细胞主要特征是表达转录因子Foxp3，Foxp3的表达与Treg细胞的抑制性功能密切相关。与对照组相比，T2DM患者Treg细胞中Foxp3的表达强度(MFI)明显降低〔(21.05±2.2)vs(32.43±3.12)，P=0.023〕。

2.3两组外周血Treg细胞抑制能力比较 体外抑制实验显示，T2DM患者外周血Treg细胞抑制能力明显低于对照组〔(31.17±3.78)% vs (58.62±4.98)%，P=0.019〕。

3 讨 论

本研究结果显示，与对照组相比，患者外周血Treg细胞比例没有显著变化，这说明T2DM患者外周血中所含的Treg细胞的比例没有发生异常，调节性T细胞与效应T细胞平衡的改变，不是导致T2DM患者免疫抑制能力缺陷的原因。虽然Treg细胞比例没有发生显著变化，但是其表达的转录因子Foxp3表达的MFI显著降低；同时，Treg细胞的抑制功能也显著减弱。在研究结果中，来源于健康人的外周血Treg细胞可以有效地抑制CD4+CD25-T细胞的增殖。相反，来源于T2DM患者的调节性T细胞无法有效地抑制自体对CD4+CD25-T细胞的增殖。

近年的研究表明，Treg细胞失能与Foxp3的表达降低或者异常有关〔11～14〕。本研究结果与之前的研究相一致，发现T2DM患者的免疫抑制功能缺失，很大程度上是由于Treg细胞的失能，很可能是由于这些调节性T细胞表达的转录因子Foxp3不稳定，正如本研究观察到的Foxp3表达MFI降低，使Treg细胞转变为TH1，TH2，TH17等效应细胞。目前关于Treg细胞失能与T2DM患者之间直接联系还有待深入研究。但是，Treg细胞的受损解释了为什么T2DM患者对自身抗原耐受的紊乱导致了患者更易发生自身免疫性疾病。关于T2DM患者Treg细胞失能的具体机制，还需要进一步探究。

1Kornete M，Mason ES，Piccirillo CA.Immune regulation in T1D and T2D：Prospective role of foxp3+Treg cells in disease pathogenesis and treatment〔J〕.Front Endocrinol (Lausanne)，2013；4(1)：76.

2Di Lorenzo TP，Peakman M，Roep BO.Translational mini-review series on type 1 diabetes：Systematic analysis of T cell epitopes in autoimmune diabetes〔J〕.Clin Exp Immunol，2007；148(1)：1-16.

3Arif S，Tree TI，Astill TP，etal.Autoreactive T cell responses show proinflammatory polarization in diabetes but a regulatory phenotype in health〔J〕.J Clin Invest，2004；113(3)：451-63.

4Shen BL，Qu QS，Miao SZ，etal.Study on the effects of regulatory T cells on renal function of IgAN rat model〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015；19(2)：284-8.

5Fontenot JDL，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells〔J〕.Nat Immunol，2003；4(4)：330-6.

6Kim JML，Rasmussen JP，Rudensky AY.Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice〔J〕.Nat Immunol，2007；8(2)：191-7.

7Hall BM.T Cells：Soldiers and spies-the surveillance and control of effector t cells by regulatory T cells〔J〕.Clin J Am Soc Nephrol，2015；10(11)：2050-64.

8Matejuk A，Beardall M，Xu Y，etal.Exclusion of natural autoantibody-producing B cells from IgG memory B cell compartment during T cell-dependent immune responses〔J〕.J Immunol,2009；182(12)：7634-43.

9Zeng C，Shi X，Zhang B，etal.The imbalance of Th17/Th1/Tregs in patients with type 2 diabetes：relationship with metabolic factors and complications〔J〕.J Mol Med，2012；90(2)：175-86.

10Dhuban BK，Kornete M，Mason SE，etal.Functional dynamics of Foxp3+regulatory T cells in mice and humans〔J〕.Immunol Rev，2014；259(1)：140-58.

11Chauhan SK，Saban DR，Lee HK，etal.Levels of Foxp3 in regulatory T cells reflect their functional status in transplantation〔J〕.J Immunol，2009；182(1)：148-53.

12Moes N，Rieux-Laucat F，Begue B，etal.Reduced expression of Fox P3 and regulatory T-cell function in severe forms of early-onset autoimmune enteropathy〔J〕.Gastroenterology，2010；139(3)：770-8.

13Long SA，Cerosaletti K，Bollyky PL，etal.Defects in IL-2R signaling contribute to diminished maintenance of FOXP3 expression in CD4(+)CD25(+) regulatory T-cells of type 1 diabetic subjects〔J〕.Diabetes，2010；59(2)：407-15.

14Francisco C，Catai A，Moura-Tonello S，etal.Cytokine profile and lymphocyte subsets in type 2 diabetes〔J〕.Brazilian J Med Biol Res，2016；49(4)：e5062.