牛磺酸锌对慢性染汞大鼠皮层内胆囊收缩素阳性神经元的影响

王　衍　陈　玲　张海峰

(沧州医学高等专科学校，河北　沧州　061000)

汞作用于中枢神经系统，会造成人或动物学习记忆能力的减退〔1〕。胆囊收缩素(CCK)是一种与学习记忆功能密切相关的神经肽，主要分布于皮质和海马结构〔2〕。本研究探讨牛磺酸锌(TZC)对慢性染汞大鼠皮层CCK阳性神经元的影响。

1　材料与方法

1.1分组及实验动物的准备天津市实验动物中心提供的健康成年雄性大鼠32只。共分为4组各8只。对照组：饲单蒸水；染汞组：饲0.6 g/L氯化汞溶液后饲单蒸水；汞+低剂量TZC组：饲含0.6 g/L氯化汞溶液后饲0.23 g/L TZC溶液；汞+高剂量TZC组：饲0.6 g/L氯化汞溶液后饲0.46 g/L TZC溶液；汞摄入量均控制在4.3 mg·kg-1·d-1，饲料均为普通饲料。喂养1个月后进行实验。

1.2迷宫实验采用张家港市生物医学仪器厂生产的MG3型三臂迷宫进行测试，迷宫的每个臂内，光、电刺激不同时出现，且保持三臂中两臂有电刺激、一臂有光刺激。将大鼠放入光刺激臂内适应60 s，切换光刺激臂，待大鼠进入光刺激臂后计时，每隔30 s随机切换光刺激臂，共切换20次/d。最后一次切换后，待大鼠进入光刺激臂并适应30 s后将大鼠取出。每只大鼠连续9次直接从电刺激臂进入光刺激臂为学会，直至所有大鼠学会实验停止，记录大鼠学会前训练的次数，绘制散点图。

1.3实验试剂Vector公司生产1∶2 000 CCK抗体、上海溶剂厂生产的多聚甲醛、Vector公司生产1∶100的卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)液等。

1.4取材和切片用0.4%戊巴比妥钠对实验大鼠进行腹腔麻醉，显露心脏，自心尖将灌注针插入左心室，开放右心耳以便灌注液排出，将生理盐水100～150 ml自左心室快速注入，之后注入4%多聚甲醛(4℃)500 ml，30～40 min内完成，迅速取出实验大鼠脑组织，用4%多聚甲醛(4℃)固定6～9 h，之后将脑组织依次置于10%，20%，30%的蔗糖溶液中各3～4 h。取右侧脑皮层置恒冷箱冰冻切片机内切片(片厚约50 μm)，用pH7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)接片。

1.5免疫组化染色将切片置入Triton-H2O2(37℃)中持续30 min，以PBS漂洗，然后用3%正常羊血清封闭30 min后，加入CCK抗体，在4℃环境下孵育72 h。漂洗后加二抗孵育60 min，漂洗后用ABC液孵育60 min，漂洗后以0.05%的二氨基联苯胺(DAB)、0.01%过氧化氢(H2O2)显色、裱片、脱水、透明、封片。每组选取对应断面的切片15张，分别计数染色阳性神经元。

1.6统计学处理采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析及LSD检验。

2　结　果

2.1迷宫实验与对照组〔(63.38±13.70)次〕相比，染汞组〔(96.13±7.57)次〕、汞+低剂量TZC组〔(92.00±13.21)次〕、汞+高剂量TZC组〔(78.75±19.02)次〕学会之前的训练次数明显增高(P<0 05)；与染汞组比较，汞+高剂量TZC组在迷宫实验中学会前的训练次数明显减少(P<0 05) 。

2.2免疫组化染色结果与对照组(99.80±9.15)相比，各组皮层CCK阳性神经元数均明显减少(P<0.05)，汞+低剂量TZC组与汞+高剂量TZC组大鼠皮层胆囊收缩素阳性神经元数(80.07±5.50、89.33±7.12)较染汞组明显增多(69.67±7.22，P<0.05)。汞+高剂量TZC组较汞+低剂量TZC组皮层CCK阳性神经元数明显增多(P<0.05)。

3　讨　论

CCK参与内脏调节和感觉传导，具有较强的兴奋作用，CCK在脑组织中主要以硫酸化八肽CCK形式存在。有实验证实〔3〕，给实验动物注射CCK后，可明显提高实验动物学习记忆能力，注射CCK抗血清后，实验动物的学习记忆能力明显下降。研究证实〔4〕，CCK增加实验动物皮层细胞和海马星形胶质细胞内钙离子的浓度，由此推断，CCK可能通过增高实验动物细胞内钙离子浓度，进而激活一氧化氮合酶，升高脑组织一氧化氮水平，最终达到促进学习记忆的效果。汞对中枢及周围神经系统都会造成损伤，对中枢神经系统的损伤主要表现在精神行为控制能力下降、学习记忆能力下降等。其作用机制可概括为：①氧化应激作用；②导致星形胶质细胞数量变化；③影响神经细胞内钙离子的平衡；④阻碍神经递质的正常生理功能等。

牛磺酸具有多种生理功能，在免疫系统、消化系统、生殖系统及神经系统维持生理功能方面发挥重要调节作用。锌是人体必需的微量元素，含量及摄入量很少，主要分布在肝脏、肌肉和骨骼中，对机体的生殖发育、脑组织发育及认知能力的形成具有重要作用，而且体内多种酶类需要锌的参与才能发挥作用，缺锌会导致机体免疫力下降及神经组织损伤。TZC作为锌与牛磺酸形成的络合物，可以有效防止锌在通过消化道时形成不溶性的化合物或被不溶性的胶体吸附，还可以防止氧化及其他金属元素对锌的拮抗作用，TZC在消化道内可以以氨基酸的形式被吸收而不依赖于载体，具有更好的生物利用度，在对机体学习记忆能力的保护方面能起到更好的作用〔5〕。

本研究结果推断可能是由于汞离子进入机体后，导致脂质过氧化，损伤DNA分子，大量消耗体内活性巯基，机体清除自由基的能力下降，造成对机体的损伤。谷胱甘肽抗氧化物酶系统在保护氧化损伤方面具有重要作用，汞离子进入机体后，大量消耗还原型谷胱甘肽，造成线粒体及细胞内大量活性氧聚积，导致细胞死亡信号传导系统被激活，汞离子进入体内后，抑制谷胱甘肽过氧化物酶等抗过氧化物酶的活性，使机体清除自由基的能力下降，同时又产生大量自由基，进一步增强脂质过氧化反应。另外汞离子还可通过打破钙离子的平衡，使细胞内钙离子聚积，进而激活核酸内切酶、破坏DNA双链结构，还可使细胞凋亡基因大量表达，从而导致细胞凋亡。

本实验说明汞确实对实验大鼠的学习记忆能力产生了明显的抑制作用。本研究说明TZC对大鼠皮层胆囊收缩素神经元数有明显的保护作用。生物体内，汞离子的作用是保护生物膜、保护细胞膜、清除自由基、防止自由基损伤等，汞离子相对于锌离子具有更强的组织亲和力，对锌离子具有竞争性抑制作用，所以当汞离子进入体内后，体内锌稳态被打破，造成体内锌水平下降，导致需要锌离子参与的某些生化反应的酶类活性降低，如超氧化物歧化酶等，实验大鼠摄入汞离子后，这种竞争性抑制得到一定程度的缓解，而且锌是超氧化物歧化酶的重要组成，后者参与机体的抗脂质氧化作用，此外锌能够使谷氨酸诱导细胞凋亡基因的作用得到抑制，从而降低汞对机体的损伤；牛磺酸在中枢神经系统中含量较高，具有抗氧化、保护细胞膜等多种生理功能，研究显示〔6〕，牛磺酸对神经细胞内钙离子浓度具有双向调节作用，防止细胞内钙超载，能明显提高神经元的存活率，促进神经系统生长发育、增殖分化，增强大鼠学习记忆的作用。牛磺酸还有作为抗氧化剂和细胞调节因子参与保护神经元的作用〔7～9〕。 牛磺酸对细胞膜的保护作用和对钙离子稳态的调解作用还可以抑制汞离子对血脑屏障的破坏。

本实验饲喂的锌是与牛磺酸配位的有机锌，更易于被吸收，推断其机制可能为：①牛磺酸根起到了小分子配体的作用，有效防止了络合锌的形成；②牛磺酸根激活消化道细胞膜上的锌离子载体，加速锌的吸收；③牛磺酸激活细胞膜上的钠钾泵，造成产能增加，锌的吸收加快。因此当锌与牛磺酸合用时能够对实验动物的神经细胞起到更好的保护作用。

本研究提示，TZC对大鼠皮层CCK神经元数的保护作用与TZC的剂量密切相关；但有研究显示〔10，11〕：补锌量低或高其保护作用都达不到最佳效果，有关牛磺酸锌对神经系统发挥保护作用的最佳剂量确定还有待进一步研究。

1Dewied KG.Peptidexgic modulation of learning and memory processses〔J〕.Pharmacol Rev，2004；46：269-91.

2Wettstein JG，Bueno L，Junien JL.CCK antagonists：phannacology and therapeutic interest〔J〕.Phannac Ther，2005；62：267-82.

3Meziane H，Devigen C，Tramu G，etal.Effect of anti-CCK-8 antiserum on acquisition and retrieval by mice in an appetitive task〔J〕.Peptides，2001；14：67-73.

4Muller W，Heinemann U，Berlin K.Cholecystokinin activates CCKB receptor mediated Casignaling in hippocampal astrocy〔J〕.J Neurophysiol，2004；78：1997-2001.

5石磊，糜志远，张迎庆，等.牛磺酸锌的研究进展〔J〕.广州化工，2012；40(7)：57-9.

6Chen XC，Pan ZL，Liu DS，etal.Effect of taurine on human fetal neuron cells：proliferation and differentiation〔J〕.Adv Exp Med Biol，1998；442：397-403.

7Rivas-Arancibia S，Willing AE，Zigova T，etal.The effects of taurine on hNT neurons transplanted in adult rat striatum〔J〕.Cell Transplant，2011；9：751-8.

8Hilgier W，Zielinska M，Boikowska HD，etal.Changes in the extracellular profiles of neuroactive Am ino acids in the rat striatum at the asymptomatic stage of hepatic failure〔J〕.J Neurosci Res，2003；56：76-84.

9Keys SA，Zmerman WF.Antioxidant activity of retinal，glutathione，and taurine in bovine photoreceptor cell membranes〔J〕.Exp Eye Res，2011；68：693-702.

10刘文波，高贝贝，杨春燕，等.牛磺酸锌对铅暴露大鼠脂质过氧化损伤的拮抗作用〔J〕.现代预防医学，2015；42(6)：1002-8.

11Kan TY，Chio CC，Lm MT，etal.Hypothalamic dopamine release and local carebral blood flow during onset of heat-5 troke m rats〔J〕.Stroke，1994；25：2483-7.