过表达含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶18基因抑制人骨肉瘤细胞的增殖与迁移

柴　瑛　

(佳木斯大学附属第一医院骨科，黑龙江　佳木斯　154002)

骨肉瘤是起源于间叶组织，主要发生于长骨的干骺端，具有恶性度高、易于转移、预后差，生存期短及病死率高等特点〔1〕。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶(ADAMTS)18基因属于ADAMTS 家族成员，可表达调控多种疾病过程的一种金属蛋白酶。在多种肿瘤中均可发现ADAMTS18基因启动子高甲基化失活和低表达，而活化ADAMTS18基因可对肿瘤的增殖和侵袭起到抑制作用，故它被认为是一种抑癌基因〔2，3〕。本实验通过研究过表达ADAMTS18基因对骨肉瘤细胞增殖与迁移的作用及其机制，以明确该基因在骨肉瘤中的生物学功能和潜在的分子机制。

1　材料与方法

1.1实验用细胞、材料及试剂143B和U-20S人骨肉瘤细胞(美国菌种保藏中心)；RPMI1640、DMEM E培养液及胰蛋白酶(Hyclone)；胎牛血清 (FBS，Gibco)；Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)；遗传霉素(G418，Sigma)；青、链霉素(碧云天生物)；细胞计数试剂盒8(CCK-8，博士德)；细胞迁移小室(Transwell小室，Corning)；兔抗人ADAMTS18多克隆抗体(Abcam)；兔抗人蛋白激酶B(AKT)单克隆抗体(CST)；鼠抗人 β-actin 单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(中杉金桥)。

1.2细胞培养143B细胞和U-20S细胞所用培养基分别为含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM和RPMI1640，细胞培养环境为37℃、5% CO2培养箱。

1.3转染实验将对数生长期的143B和U-20S 细胞分别培养于6孔板中(2×105个/孔)；待细胞生长融合度达到70%以上时，按Lipofectamine 2000转染试剂说明书将ADAMTS18表达载体和空载体分别转染入两株细胞；细胞培养48 h后，用含400 μg/ml G418 的培养基进行筛选；Western印迹实验鉴定阳性克隆。

1.4增殖实验将空载体转染的143B细胞株(V-143B)、过表达ADAMTS18基因的143B细胞株(A-143B)、空载体转染的U-20S细胞株(V-U-20S)、过表达ADAMTS18基因的U-20S细胞株(A-U-20S)制备单细胞悬液并接种于96孔板中(3×103/孔)；分别在细胞培养的24、48和72 h，向孔板中加入CCK-8试剂(10 μl/孔，每株细胞设6个复孔)，37 ℃培养箱中孵育2 h后酶标仪读取450 nm吸光度(OD)值。

1.5迁移实验分别将100 μl不含FBS的V-143B、A-143B、V-U-20S和A-U-20S细胞悬液(1.5×105个/ ml)滴加入Transwell上室，24孔板下室中为600 μl含10% FBS培养基；分别在细胞培养的24、48 h，用棉签轻轻擦拭小室内表面以去除未穿越细胞，甲醇-结晶紫固定染色后计算穿膜细胞数。

1.6Western印迹40 μg细胞总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转膜，4%牛血清白蛋白37℃封闭1 h，分别用ADAMTS18抗体(1∶1 000)、AKT抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶2 000)4℃反应过夜；洗膜后用山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶10 000)37℃孵育45 min；洗膜、显色、拍照后，以β-actin光密度值为内参照，测算各蛋白相对表达量。

1.7统计学方法采用SPSS19.0软件行t、q检验。

2　结　果

2.1过表达细胞的鉴定V-143B、V-U-20S、A-143B和A-U-20S细胞ADAMTS18相对表达量分别为(0.253 8±0.095 5)、(0.527 8±0.126 9)、(1.378 6±0.123 2)和(1.577 4±0.179 8)。两株细胞的稳定转染株与各自空载体转染株差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2ADAMTS18下调骨肉瘤细胞AKT蛋白表达量V-143B、V-U-20S、A-143B和A-U-20S细胞AKT相对表达量分别为(1.261 2±0.087 5)、(1.524 4±0.197 5)、(0.527 8±0.077 1)和(0.354 2±0.090 4)。与各自空载体转染细胞株比较，两株细胞稳定转染株AKT相对表达量显著降低(P<0.01)。见图1。

2.3ADAMTS18抑制骨肉瘤细胞增殖细胞培养48、72 h，A-143B细胞OD值显著低于V-143B(P<0.05)；细胞培养24、48和72 h，A-U-20S细胞OD值显著低于V-U-20S(P<0.05)。见表1。

2.4ADAMTS18抑制骨肉瘤细胞迁移细胞培养48 h，A-143B细胞迁移数量值显著低于V-143B(P<0.05)；细胞培养24、48 h，A-U-20S细胞迁移数量值显著低于V-U-20S(P<0.05；P<0.01)。见表2。

图1　Western印迹检测ADAMTS18和AKT基因的表达

组别24h48h72hV⁃143B05165±0063908625±0039413485±00784A⁃143B04993±0057807843±007411)12387±003891)V⁃U⁃20S04095±0064006625±0044710665±01002A⁃U⁃20S03408±003751)05978±003812)09348±004642)

与V-143B比较：1)P<0.05,与V-U-20S比较：2)P<0.05

表2　过表达ADAMTS18抑制骨肉瘤细胞的迁移

与V-143B比较：1)P<0.05；与V-U-20S比较：2)P<0.05,3)P<0.01

3　讨　论

ADAMTSs可参与组织发育、重建、炎症反应、癌症和血管生成等多种生物学过程〔4〕。ADAMTSs金属蛋白酶结构域可介导细胞外基质蛋白的降解，生长因子、细胞因子和黏附分子的释放、脱落，并进而调控细胞增殖、迁移和血管生成〔5〕。由于之前对ADAMTS18功能和底物知之甚少，故ADAMTS18一度被认为是ADAMTSs 家族的“孤儿”。研究报道，在胃癌、结直肠、胰腺和透明细胞肾细胞癌中，均可发现ADAMTS18高甲基化失活或表达下调〔6，7〕。黏附因子β-链蛋白及其下游靶基因细胞周期蛋白D1、原癌基因异常激活在肿瘤发生中具有重要作用〔8〕，Lu等〔4〕报道，在小鼠模型中ADAMTS18表达缺乏经上调β-catenin表达和活化p38MAPK/ERK1/2信号促进结肠致癌作用。本研究证实上调ADAMTS18表达可抑制骨肉瘤细胞的恶性表型、下调AKT蛋白水平；与Xu等〔2〕在乳腺癌中的结研究果相一致，由此可见，下调AKT通路活性亦是ADAMTS18抑制肿瘤恶性表型的一种可能机制。

1Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2015;65(2)：87-108.

2Xu H，Xiao Q，Fan Y，etal.Epigenetic silencing of ADAMTS18 promotes cell migration and invasion of breast cancer through AKT and NF-κB signaling〔J〕.Cancer Med,2017;6(6)：1399-408.

3徐红英，肖茜，范宇，等.ADAMTS18基因过表达可抑制人乳腺癌细胞的迁移与侵袭〔J〕.肿瘤，2016;36(7)：749-57.

4Lu T，Dang S，Zhu R，etal.ADAMTS18 deficiency promotes colon carcinogenesis by enhancing β-catenin and p38MAPK/ERK1/2 signaling in the mouse model of AOM/DSS-induced colitis-associated colorectal cancer〔J〕.Oncotarget，2017;8(12)：18979-90.

5Rocks N，Paulissen G，El Hour M，etal.Emerging roles of ADAM and ADAMTS metalloproteinases in cancer〔J〕.Biochimie，2008;90(2)：369-79.

6Li L，Tao Q，Jin H，etal.The tumor suppressor UCHL1 forms a complex with p53/MDM2/ARF to promote p53 signaling and is frequently silenced in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2010;16(11)：2949-58.

7Xu B，Zhang L，Luo C，etal.Hypermethylation of the 16q23.1 tumor suppressor gene ADAMTS18 in clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Int J Mol Sci，2015;16(1)：1051-65.

8Vermeulen L，De Sousa E，Melo F，etal.Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironmen〔J〕.Nat Cell Biol，2010;12(5)：468-76.