辣椒素通过抑制自噬活性抑制实验性自身免疫性神经炎

周寿红，薛瑞瑞，郭潇潇，盛思敏，杜 倩，夏嘉辉，肖 婷，林 芬

(南华大学医学院生理学教研室，湖南 衡阳 421001)

实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)是一种自身免疫性疾病，是人类吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)经典的动物模型[1]。EAN病变范围主要波及周围神经系统的髓鞘和轴索，其主要的病理特征是周围神经和神经根髓鞘脱失、轴索变性，神经干内及神经纤维周围巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润，属于神经变性疾病[2]。EAN和GBS的发病机制还未完全阐明，也缺乏理想的治疗手段。

辣椒素(capsaicin)是从茄科植物辣椒中提取的一种生物碱，其化学名称为8-甲基-N-草香酸-6-壬烯酰胺。辣椒素是瞬时受体电位通道香草醛亚型-1(transient receptor potential vanilloid type-1, TRPV1)的高选择性激动剂[3-4]。TRPVl在炎症的发展过程中发挥着重要作用，TRPV1激动后能影响P物质、降钙素基因相关肽、神经激肽A等的释放，发挥抗炎的作用[5-6]。但是辣椒素对EAN的作用目前还不清楚。自噬是真核生物细胞中降解和回收利用细胞内的长寿蛋白质、生物大分子和受损细胞器的过程。研究显示，细胞自噬参与了多种神经变性疾病的发病机制[7-8]。因此，本研究建立EAN大鼠模型，观察辣椒素对EAN的影响，从细胞自噬的角度探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1药品与试剂辣椒素由碧云天生物技术公司提供(批号：P0045)；周围神经髓鞘抗原(P257-81)多肽由上海吉尔生化有限公司提供(批号：2017040317)；完全弗氏佐剂(批号：089M01721C)和雷帕霉素(rapamycin, RAPA,批号：09101748)购自美国Sigma公司；劳克坚牢蓝为上海远慕生物科技有限公司产品(批号：DJ548)；兔抗大鼠Beclin-1(批号：sc-58742-R)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein light chain-3, LC3，批号：sc-47821)、p62(批号：sc-58241)、β-actin(批号：sc-58742-R)单克隆抗体和相应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(批号：sc-58742-R)，均购自美国Santa Cruz公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α,批号：170305)、干扰素γ (interferon gamma, IFN-γ，批号：170226)、白介素-1β(interleukin 1β, IL-1β，批号：170308)和白介素-6(interleukin-6, IL-6，批号：170314)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2仪器TECNAI 20 U-TWIN型透射电镜为荷兰飞利浦电子光学公司产品；F.A.M.E.16/20型全自动酶标仪为瑞士哈美顿公司产品；UV-3600型紫外分光光度计为日本岛津产品；SZ51/SZ61型光学显微镜为日本奥林巴斯公司产品。

1.3动物模型的建立及实验分组♂ Lewis大鼠，8～10周龄，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。将100 μg的P257-81多肽溶解于100 μL的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PBS)，再加入100 μL完全弗氏佐剂，混匀成抗原乳剂。通过在每只大鼠的后肢足底分别注射100 μL抗原乳剂，诱导EAN大鼠模型。实验分为对照组(Control)、EAN模型组(EAN)、辣椒素组(Capsaicin)、EAN+辣椒素组(EAN+Capsaicin)、雷帕霉素组(RAPA)、EAN+雷帕霉素组(EAN+RAPA)和EAN+辣椒素+雷帕霉素组(EAN+Capsaicin+RAPA)，每组10只。辣椒素组大鼠每天给予辣椒素(1 mg·kg-1)灌胃[6]，共15 d；EAN+辣椒素组大鼠每天在免疫后1 h给予辣椒素(1 mg·kg-1)灌胃，共15 d；雷帕霉素组大鼠在免疫后0.5 h通过腹腔注射给予雷帕霉素(2.5 mg·kg-1)，共15 d；EAN+雷帕霉素组大鼠每天在免疫后0.5 h通过腹腔注射给予雷帕霉素(2.5 mg·kg-1)，共15 d；EAN+辣椒素+雷帕霉素组大鼠每天在免疫后0.5 h通过腹腔注射给予雷帕霉素(2.5 mg·kg-1)，再在免疫后1 h给予辣椒素(1 mg·kg-1)灌胃，共15 d。

1.4大鼠神经系统体征临床评分抗原乳剂注射后，每天对大鼠的神经系统体征进行评分，评分标准如下：大鼠没有表现出明显的异常评为0分；肌张力明显降低，鼠尾松弛无力评为1分；大鼠的翻正反射部分消失，鼠尾出现瘫痪评为2分；大鼠的翻正反射全部消失评为3分；大鼠出现姿态异常，并存在共济失调现象评为4分；大鼠的后肢出现轻度瘫痪评为5分；大鼠的后肢出现中度瘫痪评为6分；大鼠的后肢出现严重瘫痪评为7分；大鼠四肢均出现瘫痪评为8分；大鼠处在濒临死亡的状态评为9分；大鼠死亡评为10分[9]。

1.5坐骨神经病理形态学观察辣椒素处理15 d后处死动物，取出大鼠右侧坐骨神经，取靠近中枢的部分神经组织用于病理切片，余下的神经组织用于透射电镜检查。采用HE染色观察神经组织中炎症细胞浸润，劳克坚牢蓝染色观察神经纤维脱髓鞘现象。在显微镜下观察切片，每张切片随机取5个视野，计数大鼠坐骨神经横断面浸润的炎症细胞数量，结果以炎症细胞数/mm2组织切片表示。

1.6ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6的水平辣椒素处理15 d后，尾静脉采血，1 500 r·min-1离心5 min，收集上清液。在酶标板的每个检测孔中加待测样本50 μL，每孔加入酶结合物50 μL，空白对照孔不加，37℃孵育2 h。弃去孔内液体，每孔先加入显色剂100 μL，混匀，37℃孵育15 min。空白对照孔调零，设定波长为450 nm，用酶标仪测定各孔的OD值。根据标准曲线，计算血清标本中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6的水平。

1.7坐骨神经超微结构观察辣椒素处理15 d后处死动物，取余下的右侧坐骨神经，0.2 mol·L-1戊二醛在4℃固定2 h。经常规脱水、包埋、超薄切片和重金属染色后，采用透射电镜观察神经纤维的超微结构及细胞中的自噬体情况，并拍照记录，计算每个视野轴突横截面中自噬体数量。

1.8Westernblot检测辣椒素处理15 d后处死动物，取大鼠左侧坐骨神经，用预冷的PBS冲洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上碾磨裂解30 min，提取总蛋白。2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠法定量样本的蛋白浓度。总蛋白样本加入上样缓冲液，充分煮沸变性蛋白。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移到PVDF膜。牛血清白蛋白溶液室温下孵育2 h封闭非特异性抗原。加入Beclin-1(1 ∶150)、LC-3(1 ∶200)、p62(1 ∶200)、β-actin(1 ∶400)的一抗，4℃过夜。洗膜后加入相应的二抗，室温下脱色摇床上缓慢摇晃继续孵育2 h。洗膜后用ECL试剂盒显色，清洗终止反应。Chemi DocMP多色荧光凝胶成像分析系统观察并记录结果，采用Image J软件进行灰度分析，分析目的蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1辣椒素对EAN大鼠神经系统体征临床评分和体质量的影响如Fig 1所示，EAN组大鼠在免疫后d 6出现首发症状，临床评分为(1.53±0.24)，此后神经系统体征临床评分逐渐升高，在免疫后d 15达到最高，临床评分为(7.54±0.56)。与对照组比较，EAN组大鼠从免疫后d 6～16神经系统体征临床评分均明显升高(P<0.05)。EAN组大鼠在免疫后d 2开始出现体质量的减轻，从免疫后d 3～16体质量均明显低于对照组(P<0.05)。对照组和辣椒素组大鼠没有观察到神经功能的缺损，两组大鼠体质量也没有明显差异(P>0.05)。与EAN组比较，EAN+辣椒素组大鼠从免疫后d 7～16神经系统体征临床评分均明显降低(P<0.05)，从免疫后d 3～16体质量均明显增加(P<0.05)。

2.2辣椒素对EAN大鼠坐骨神经的髓鞘脱失和炎性细胞浸润的影响如Fig 2所示，与对照组比较，EAN组大鼠坐骨神经中可观察到明显的髓鞘脱失现象，炎症细胞浸润数明显增加(P<0.05)。与EAN组比较，EAN+辣椒素组大鼠坐骨神经中髓鞘脱失现象明显减少，炎症细胞浸润数明显减少(P<0.05)。

2.3辣椒素对EAN大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平的影响如Tab 1所示，与对照组比较，EAN组大鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6水平明显增加(P<0.05)。与EAN组比较，EAN+辣椒素组大鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05)。

Fig 1 Effect of capsaicin on clinical scores of neurological signs (A) and body weight (B) in rats with EAN*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs EAN group

Fig2EffectofcapsaicinondemyelinationandinflammatorycellinfiltrationofsciaticnerveinratswithEAN(×200)

Arrows indicates nerve fiber with demyelination.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEAN group

Fig 3 Effect of capsaicin on ultrastructure ofsciatic nerve in rats with EAN

Arrows indicates the autophagosome.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEAN group

Tab 1 Effect of capsaicin on levels of serum TNF-α, IFN-γ, IL-1β and IL-6 in rats with EAN(±s, n=10)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsEAN

2.4辣椒素对EAN大鼠坐骨神经超微结构的影响如Fig 3所示，与对照组比较，EAN组大鼠坐骨神经轴突中自噬体数量明显增加(P<0.05)。与EAN组比较，EAN+辣椒素组大鼠坐骨神经轴突中自噬体数量明显减少(P<0.05)。

2.5辣椒素对EAN大鼠坐骨神经组织中自噬相关蛋白表达的影响如Fig 4所示，与对照组比较，EAN组大鼠坐骨神经中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高，p62的表达明显降低(P<0.05)。与EAN组比较，EAN+辣椒素组大鼠坐骨神经中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显降低，p62的表达明显升高(P<0.05)。

Fig 4 Effect of capsaicin on expressions of autophagy relatedprotein Beclin-1, p62 and LC3-Ⅱ(A) and ratio of LC3-Ⅱ andLC3-Ⅰ (B) of sciatic nerve in rats with EAN

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEAN group

2.6自噬诱导剂RAPA对辣椒素抑制大鼠EAN作用的影响如Fig 5所示，与EAN+辣椒素组比较，EAN+辣椒素+雷帕霉素组大鼠从免疫后d 8～16神经系统体征临床评分均明显升高(P<0.05)，从免疫后d 6～16体质量均明显增加(P<0.05)，表明雷帕霉素部分逆转了辣椒素的作用。

Fig 5 Effect of autophagy inducer RAPA on inhibitoryaction of capsaicin in rats with EAN

A: Clinical scores of neurological signs; B: Body weight.#P<0.05vsEAN+capsaicin group

3 讨论

GBS是一种周围神经和神经根的急性自身免疫性炎症性疾病，主要表现为四肢麻木、肢体无力、四肢对称性迟缓性瘫痪、面神经麻痹、眼外肌麻痹、共济失调、腱反射消失等症状。周围神经的脱髓鞘以及炎症细胞的浸润是本病的主要病理特点。EAN与人类的GBS具有相似的临床、组织病理学和电生理学特征及免疫学改变，是研究GBS的经典动物模型[10]。本实验结果显示，辣椒素能明显降低EAN大鼠的神经系统体征临床评分，明显增加EAN大鼠的体质量，减少EAN大鼠的坐骨神经髓鞘脱失现象，减少EAN大鼠的坐骨神经中炎症细胞浸润，降低大鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的水平。这些结果表明辣椒素具有抗EAN的作用。

辣椒素是辣椒中最主要的有效成分，辣椒素通过与辣椒素受体结合后，开放阳离子通道，导致细胞外的钙离子内流，调节多种炎症介质包括组胺激肽、P物质和前列腺素的释放[11]。研究显示，辣椒素对炎症有抑制作用。周琦等[6]研究发现，辣椒素对慢性萎缩性胃炎具有良好的治疗作用。符涛等[12]的研究结果表明，辣椒素对急性痛风性关节炎的炎症反应具有抑制作用。本研究的结果也证实辣椒素具有抗炎作用，对EAN具有抑制作用，但其机制不明。

研究显示，自噬与神经退行性疾病的发生、发展关系密切，而EAN是一种以髓鞘脱失、轴索变性和炎症细胞浸润为特征的神经退行性疾病[13-14]。因此，进一步检测了EAN大鼠中自噬的水平。结果显示，EAN大鼠坐骨神经轴突中自噬体数量明显增加，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高，p62的表达明显降低，表明在EAN中自噬活性水平的增加，因而EAN的神经轴突中自噬水平的增加可能是导致轴索变性的原因。但是神经轴突中自噬活性水平的增加是否参与髓鞘脱失的发生呢？有研究表明，小鼠视网膜节细胞轴突内自噬体可以释放到细胞周围，被周围的细胞吞噬处理[15]。构成髓鞘的施旺细胞同样具有吞噬能力，施旺细胞吞噬大量由轴突转移出来的自噬体后，可能损伤施旺细胞，导致髓鞘溶解和髓鞘脱失，但是这种可能还需进一步的研究证实。本研究的结果显示，辣椒素明显降低了EAN模型大鼠坐骨神经轴突中自噬体数量，降低Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，增加p62的表达，而自噬诱导剂雷帕霉素部分地逆转辣椒素的作用。这表明辣椒素抑制了EAN中自噬活性，这可能是辣椒素抑制EAN的机制之一。

(致谢：本实验在南华大学神经科学研究所实验室完成，对本实验的参与人员表示感谢。)

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