下调SLP- 2基因表达抑制脑胶质瘤细胞增殖及诱导凋亡的机制研究

陈小忠 王 培 谢明祥 赵洪新 吴海涛

(遵义医学院附属医院神经外科,遵义 563003)

脑胶质瘤是常见的起源于神经外胚层的中枢神经系统恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的45%，具有复发率高、病死率高及治愈率低等特性，手术治疗无法根治且对常规使用的化放疗药物不敏感，预后很差[1]。肿瘤的发生是一个多阶段、多因素的过程，包括抑癌基因、癌基因、DNA损伤修复基因的表观遗传变异及突变。研究胶质瘤发生及发展的生物学特性、分子机制对该病的诊断及治疗具有重要意义。人的 Stomatin like protein 2(SLP- 2)基因定位于9p13.1，是2000年首次发现并命名的一个新基因，SLP- 2蛋白被认为是一种细胞膜相关蛋白[2]。已有研究显示，SLP- 2基因在前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤中存在高表达[3,4]，将SLP- 2的反义基因导入甲状腺癌、食管鳞癌等肿瘤可促进癌细胞的恶性生长及增殖，并参与癌症的转移[5,6]。有研究显示SLP- 2基因在脑胶质瘤也有高表达，但对脑胶质瘤细胞的生物学特性研究尚未清楚。本研究中通过RNA干扰技术沉默脑胶质瘤细胞中SLP- 2基因表达，观察细胞增殖和凋亡变化，并研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人脑胶质瘤SHG44细胞株购自上海生命科学研究院细胞库；胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自大连TaKaRa公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)试剂盒、CCK8试剂盒、膜联蛋白V- FITC(Annexin V- FITC)/碘化丙锭(PI)试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；SLP- 2、B细胞淋巴瘤/白血病- 2(B cell lymphoma/leukemia- 2，Bcl- 2)、Bcl- 2相关X蛋白(Bcl- 2 associated X protein,Bax)、Notch1、Hes1、GAPDH抗体均购自美国Abcam公司；酶标仪、流式细胞仪均购自美国Bio- Rad公司；荧光定量PCR仪购自美国Bioneer。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染 人脑胶质瘤U251细胞在37℃，体积分数为5%CO2，95%饱和湿度的培养箱中用含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基(100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素)传代培养。取对数生长期的细胞用于实验研究。细胞分为空白组(细胞未做任何处理)、阴性对照组(细胞转染无义siRNA序列)和SLP- 2敲低组(细胞中转染SLP- 2的靶向siRNA序列)。转染前1天以1×106个/孔浓度接种于6孔细胞培养板中，每孔加入2 ml，细胞生长达到80%融合度以上时进行转染，转染参照LipofectamineTM2000转染说明进行操作。

1.2.2蛋白质印迹(Western blot) 取上述转染48 h 的细胞，加入适量的细胞裂解液提取细胞中的蛋白，BCA试剂盒检测提取的蛋白浓度，蛋白样品与上样缓冲液按照1∶5比例充分混匀，100℃变性5 min，每泳道30 μg蛋白样品，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分离，电泳后转移至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂奶粉溶液封闭过夜，加入一抗(SLP- 2、Bcl- 2、Bax、Notch1、Hes1抗体均按照1∶500稀释，GAPDH按照1∶1 000稀释)，4℃过夜，洗膜后加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗，37℃孵育2 h，增强型化学法(ECL)发光显色，X线片曝光，显影，定影。

1.2.3细胞增殖检测 U251细胞以每孔2×104个细胞(100 μl)接种于96孔细胞培养板上，置于37℃，体积分数5%CO2的培养箱中培养24 h进行同步化处理，按照上述分组进行转染，收集转染48 h的各组细胞，每孔细胞中加入CCK8溶液10 μl，培养板置于培养箱内孵育2 h，以不加细胞只加培养液的空白对照孔调零，酶标仪检测570 nm吸光度(A)，记录结果，实验重复3次。计算细胞增殖率。细胞增殖率=(转染组细胞A/对照组细胞A)×100%。

1.2.4细胞凋亡检测 采用Annexin V- FITC/PI双染法检测细胞凋亡。取转染后培养48 h的上述三组细胞，胰蛋白酶消化细胞，预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞2次，细胞浓度调整为1×106个/ml，Binding Buffer悬浮细胞，按照细胞凋亡试剂盒的操作说明检测各组细胞的凋亡情况。

1.2.5IL- 6、TNF- α的mRNA表达检测 RNA提取试剂盒提取转染48 h的三组细胞中的总RNA，逆转录成cDNA，以GAPDH作为内参基因，cDNA为模板，按照试剂盒的操作说明扩增IL- 6、TNF- α基因。IL- 6、TNF- α的引物序列如下:IL- 6 F：5′- AGTTGTGCAATGGCAATTCTG- 3′，R：5′- AGGACTCTGGCTTTGTCTTTC- 3′。TNF- α F：5′- ACTGGCGTGTTCATCC- GTTCT- 3′，R：5′- CGCAATCCAGGCCACTACTTC- 3′。GAPDH F：5′- ATGACCCCTTCATTGACC- 3′，R：5′- GAAGATGGTGATGGGATTTC- 3′。所有引物由上海生工合成。实验数据(Ct值)采用2-ΔΔCt法进行统计。

2 结果

2.1下调 SLP- 2表达的效果 空白组、阴性对照组、SLP- 2敲低组SLP- 2的蛋白表达分别为(0.622±0.047)、(0.628±0.046)、(0.087±0.011)，阴性对照组SLP- 2的蛋白表达与空白组差异无统计学意义(t=0.158，P=0.882)，而SLP- 2敲低组SLP- 2的蛋白表达显著低于空白组(t=19.197，P=0.000)。见图1。

2.2下调 SLP- 2表达抑制细胞增殖 空白组、阴性对照组、SLP- 2敲低组细胞存活率分别为(100.00±2.23)%、(95.86±2.12)%、(70.54±3.98)%，阴性对照组细胞存活率与空白组差异无统计学意义(t=2.331，P=0.080)，SLP- 2敲低组细胞存活率显著低于空白组(t=11.185，P=0.000)。见图2。

2.3下调 SLP- 2表达促进细胞凋亡 空白组、阴性对照组、SLP- 2敲低组细胞凋亡率分别为(1.72±0.48)%、 (1.74±0.50)%、 (17.13±1.32)%，阴性对照组细胞凋亡率与空白组差异无统计学意义(t=0.050，P=0.963)，SLP- 2敲低组细胞凋亡率显著高于空白组(t=19.003，P=0.000)。见图3。

图1 下调 SLP- 2表达的效果Fig.1 Effect of SLP- 2 down expressionNote: A.Western blot was used to detect the expression of SLP- 2 protein after transfection;B.The relative expression of SLP- 2 protein in each group cells;compared with the blank group,*.P<0.05.

图2 下调 SLP- 2表达对细胞增殖的影响Fig.2 Effect of SLP- 2 down expression on cell proliferationNote: Compared with the blank group,*.P<0.05.

图3 下调 SLP- 2表达对细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of SLP- 2 down expression on cell apoptosisNote: A.The apoptosis of each group cell was detected by flow cytometry;B.The apoptosis rate in each group;compared with the blank group,*.P<0.05.

2.4下调 SLP- 2表达对IL- 6、TNF- α表达的影响 RT- PCR检测IL- 6、TNF- α的mRNA表达，结果显示，阴性对照组IL- 6、TNF- α的mRNA表达与空白组差异无统计学意义(IL- 6t=0.312，P=0.770；TNF- αt=0.076，P=0.943)，SLP- 2敲低组IL- 6、TNF- α的mRNA表达均显著低于空白组(IL- 6t=10.808，P=0.000；TNF- αt=10.072，P=0.001)。见表1。

2.5下调 SLP- 2表达对Bcl- 2、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达的影响 Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl- 2、Bax及Notch1和靶基因Hes1的蛋白表达，结果显示，空白组、阴性对照组、SLP- 2敲低组Bax的蛋白表达分别为(0.072±0.009)、(0.063±0.009)、(0.282±0.031)，Bcl- 2蛋白表达分别为(0.315±0.032)、(0.309±0.031)、(0.192±0.027)，Notch1的蛋白表达分别为(0.711±0.048)、(0.704±0.051)、(0.112±0.014)，Hes1的蛋白表达分别为(0.342±0.028)、(0.350±0.026)、(0.047±0.007)，阴性对照组Bax、Bcl- 2、Notch1、Hes1蛋白表达与空白组差异无统计学意义(Baxt=0.817，P=0.460；Bcl- 2t=0.233，P=0.827；Notch1t=0.173，P=0.871；Hes1t=0.363，P=0.735)，SLP- 2敲低组Bcl- 2、Notch1、Hes1蛋白表达显著低于空白组，Bax蛋白表达显著高于空白组(Bcl- 2t=5.088，P=0.007；Notch1t=20.75，P=0.000；Hes1t=17.704，P=0.000；Baxt=17.331，P=0.000)。见图4。

表1下调SLP-2表达对IL-6、TNF-α表达的影响

Tab.1EffectofSLP-2downexpressiononIL-6andTNF-αexpression

GroupsmRNArelativeexpressionIL-6TNF-αBlankgroup1.000±0.1221.000±0.105NCgroup0.972±0.0961.006±0.089SLP-2knockdowngroup0.213±0.0321)0.365±0.0301)

Note：Compared with the blank group,1)P<0.05.

图4 下调 SLP- 2表达对Bcl- 2、Bax、Notch1、Hes1蛋白表达的影响Fig.4 Effect of SLP- 2 down expression on Bcl- 2,Bax,Notch1,Hes1 protein expressionNote: A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of protein;compared with the blank group,*.P<0.05.

3 讨论

脑胶质瘤具有易复发及侵袭性的特性，由于其生长部位的特殊性，手术及放化疗药物均很难达到预期效果，而使脑胶质瘤成为神经系统难以治疗的疾病之一[7]。随着分子生物学的不断发展，多种肿瘤的生物标记物在肿瘤防治中被应用。SLP- 2基因属于Stomatin基因超家族成员，在人类的多种组织中都有表达，近些年来，通过蛋白组学和基因组学发现SLP- 2在多种肿瘤中表达上调，影响癌细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学过程，被认为是一种新的肿瘤相关基因[8,9]。但关于SLP- 2对恶性肿瘤关系的报道较少。有研究显示，RNA干扰抑制胃癌细胞中SLP- 2基因的表达可降低癌细胞的增殖及阻滞细胞于G1期[10]。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA诱导的能使特异mRNA序列降解的现象，具有高效性、特异性等特点，是近些年来发现和发展起来的基因阻断技术，该技术可有效地沉默肿瘤相关基因表达、促进癌细胞凋亡、抗血管生成等，且与传统的放化疗结合，更具抗癌潜力[11,12]。本研究结果显示，RNA干扰抑制脑胶质瘤细胞中SLP- 2表达后细胞增殖显著降低，凋亡增加，炎症细胞因子IL- 6和TNF- α表达下调。Bcl- 2蛋白显著下调表达，Bax蛋白显著上调表达。细胞的凋亡是由多个因子和因素控制的，Bcl- 2家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用。Bcl- 2是Bcl- 2家族的抑凋亡基因，Bax是Bcl- 2家族的促凋亡基因，两者之间可形成同源二聚体和异源二聚体[13,14]。有研究指出，细胞的凋亡取决于Bax和Bcl- 2的比率，Bcl- 2的表达下降，而同时Bax的表达上升，发挥促细胞凋亡的作用，反之则抑制细胞的凋亡[15]。

Notch信号通路由Notch受体和配体、下游效应物、DNA结合蛋白组成，在进化上非常保守，可从多个方面对细胞的增殖、凋亡、机体发育等进行调控，影响细胞命运[16]。Notch1是Notch的一个受体，大量研究显示，在多种肿瘤中Notch1信号通路处于异常激活状态，如肺癌、脑胶质瘤等，其异常表达可通过直接或间接的作用诱导肿瘤的发生[17，18]。有研究指出，抑制脑胶质瘤细胞中Notch1信号通路可降低癌细胞的增殖及诱导细胞的凋亡[19]。Hes1是Notch1信号通路下游重要的效应分子，是其是否激活的标志。本研究检测Notch1、Hes1的蛋白表达，结果显示，抑制SLP- 2基因的表达后脑胶质瘤细胞中Notch1、Hes1蛋白显著下调表达。这说明抑制SLP- 2基因的表达可通过下调Notch1信号通路降低脑胶质瘤的发生发展。

综上所述，抑制脑胶质瘤细胞中SLP- 2基因的表达后可通过下调Notch1信号通路降低癌细胞的增殖及诱导凋亡，降低炎症细胞因子IL- 6和TNF- α表达。本研究初步证实了SLP- 2基因在脑胶质瘤发生及发展中的作用，为寻找脑胶质瘤的基因治疗靶点提供了一定的理论基础。

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