TIPE2抑制AP- 1蛋白增加人非小细胞肺癌细胞系NCI- H1975化疗敏感性的机制研究

王 颖 刘英宇 张文艳

(河北省唐山工人医院呼吸内科,唐山 063000)

TIPE2(Tumor necrosis factor- a induced protein 8- like 2，TNFAIP8L2)是2008年新发现的一个维持免疫系统自稳平衡必需的基因之一，属于TIPE家族成员，具有与死亡受体结构域相似的结构域和6个保守的α螺旋结构，TIPE2与TNFAIP8L1(TIPE1)和TNFAIP8L3(TIPE3)同属于TNFAIP8家族，是一种重要的肿瘤抑制分子[1]。

肺癌是世界范围内危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，其中80%～85%是非小细胞肺癌。根治手术是肺癌的主要治疗策略，尽管手术有所进展，但肺癌患者的5年生存率仍然不够理想，统计表明中国肺癌的中位生存期仅为22.7个月[2]。因此新型辅助化疗(例如CDDP)仍是非小细胞肺癌治疗的重要手段。尽管靶向治疗效果显著，但EGFR基因突变在吸烟的肺癌患者中发生率偏低，其突变率仅为30%，因此在吸烟患者中运用靶向治疗效果欠佳。同时在临床应用中，顺铂(CDDP)治疗则有肿瘤耐药现象发生，从而导致治疗失败，因此逆转肺癌细胞肿瘤耐药至关重要。有研究表明AP- 1蛋白在肿瘤耐药中发挥重要作用[3]，且TIPE2是AP- 1蛋白的直接抑制分子[4,5]。本研究旨在探讨TIPE2是否在逆转肿瘤耐药方面发挥重要功能。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系和载体 人非小细胞肺癌系NCI- H1975从中国科学院上海细胞生物研究所购买，并在含有10%胎牛血清(FBS)的培养基中培养(Gibco,Australia)。TIPE2慢病毒载体由上海Genechem公司构建。

1.1.2仪器与试剂 流式细胞仪为BD公司产品(FACS Calibur,BD,USA)，多功能酶标仪为Thermofisher公司产品(VarioskanFlash,Thermo,USA)；CCK8及Annexin5- PI双染凋亡试剂盒购自Dojindo公司(Dojindo,Shanghai,China)，CDDP为山东齐鲁制药有限公司产品(QiLu Pharmaceutical,Jinan,China)，实时荧光定量试剂盒PrimeScriptTM购自TaKaRa公司(TaKaRa,Dalian,China)，TRIzol 购自Invitrogen公司(Invitrogen,California,USA)，AP- 1抗体购自CST公司(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)，TIPE2抗体为Santa Cruz公司产品(Santa Cruz Biotechnology,USA)，MDR1抗体为Bio- Legend 公司产品(Bio- Legend,San Diego,CA)。

1.2方法 非小细胞肺癌系NCI- H1975转入TIPE2慢病毒载体后，加入CDDP 10 μg/ml，培养24 h，使用Cell Counting Kit- 8(CCK- 8)测量IC50值。 根据文献报道，细胞毒性指数计算为(1-药物处理细胞OD450/未处理细胞的OD450)×100%，使用GraphPad Prism 5计算CDDP的IC50值。TIPE2转染细胞后，用CDDP(10 μg/ml)处理24 h后，凋亡细胞用AnnexinV/FITC和PI凋亡检测试剂盒进行检测。使用含RIPA的蛋白裂解液提取上述经CDDP作用的细胞总蛋白，按操作说明进行，最后将膜与TIPE2抗体、AP- 1抗体及MDR- 1抗体进行孵育，胶片曝光检测蛋白表达量，GAPDH作为内参。TRIzol处理细胞后，PrimeScriptTM试剂盒提取总RNA并逆转录成cDNA,荧光定量PCR仪检测炎性因子表达水平，18S rRNA作为内参。

图1 转染TIPE2后IC50值明显降低Fig.1 Decreased IC50 after transfected with TIPE2

1.3统计学方法 采用Graphpad Prism5.0.软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析，所有数据皆采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1TIPE2降低非小细胞肺癌系NCI- H1975细胞IC50值 结果表明，用TIPE2过表达慢病毒感染的非小细胞肺癌系NCI- H1975细胞，经CDDP作用24 h后，IC50(半数致死量)测定显示与对照组相比TIPE2过表达显著增加CDDP诱导的细胞毒性(图1，P<0.001)。

2.2TIPE2增加非小细胞肺癌系NCI- H1975细胞对CDDP的凋亡率 为了进一步证实TIPE2的功能，用CDDP处理TIPE2过表达细胞及对照组。 和预期相同，过表达TIPE2组增强CDDP诱导的NCI- H1975细胞凋亡，使用Annexin V和碘化丙啶染色后流式细胞仪判断如图2所示(P<0.05)。

2.3TIPE2降低非小细胞肺癌系NCI- H1975细胞中AP- 1及MDR1的表达量 过表达TIPE2后，NCI- H1975细胞AP- 1及MDR1表达量下调，有研究表明TIPE2是AP- 1的直接作用抑制分子，而AP- 1可以增加肿瘤细胞耐药性。MDR1则是介导肿瘤耐药的主要分子之一。本实验初步表明TIPE2增强CDDP对NCI- H1975细胞的化疗敏感性可能是通过下调AP- 1分子，如图3。

2.4TIPE2降低非小细胞肺癌系NCI- H1975细胞中炎性因子IL- 1、IL- 6及TNF- α mRNA水平 用CDDP处理TIPE2过表达细胞及对照组，过表达TIPE2组中炎性因子IL- 1、IL- 6及TNF- α mRNA水平明显降低，已有研究证实炎性因子比如IL- 6的增多可诱导肿瘤细胞耐药性，本结果表明TIPE2可能通过抑制AP- 1间接降低炎性因子分泌，从而降低肿瘤细胞耐药性。如图4所示(P<0.01)。

图2 TIPE2增加CDDP诱导的细胞凋亡Fig.2 Increased apoptosis after transfected with TIPE2Note: *.P<0.05.

图3 TIPE2 明显降低AP- 1及MDR1蛋白表达水平Fig.3 Decreased expression of AP- 1 and MDR1 after transfected with TIPE2

图4 TIPE2 明显降低IL- 1、IL- 6及TNF- α mRNA表达水平Fig.4 Decreased mRNA expression of IL- 1，IL- 6 and TNF- α after transfected with TIPE2Note: *.P<0.01.

3 讨论

对于不适合靶向治疗的非小细胞肺癌患者，肿瘤耐药仍然是治疗失败的重要原因，特别是那些IV期癌症患者。肿瘤耐药机制主要包括ATP结合转运体超家族(例如MDR1)介导的细胞内药物聚积及药物流出增加，p53、Bcl- 2或miRNAs介导的凋亡抑制机制，以及表达上调的错配修复基因等[6]。研究数据显示，MDR1的表达增加与肿瘤细胞耐药密切相关，MDR1编码的蛋白P- gp过表达对肿瘤进展有促进作用，使其有更高的复发率和转移风险[7,8]。因此，调控MDR1被认为是克服肿瘤耐药的主要策略之一。

已有研究证实TIPE家族另一成员TIPE(TNFAIP8)在胃癌肿瘤耐药中发挥重要作用[9]。TIPE2是炎性疾病的负调节因子，一般情况下，TIPE2表达降低与肿瘤转移密切相关，与肿瘤分期呈高度负相关性[1]。研究发现TIPE2通过抑制HCC中AKT和Ral的激活，可以结合并抑制Rac蛋白[10]。此外，TIPE2可抑制TNF介导的Erk1/2和NF- κB通路的活化[11]，并通过上调N- ras和p27表达阻止胃癌细胞增殖[12]。然而迄今为止，还没有关于TIPE2在肿瘤耐药机制中的作用研究。本研究首次发现在过表达TIPE2的非小细胞肺癌系NCI- H1975细胞对CDDP敏感性增强，表现为IC50(半数致死量)明显降低，表明转染TIPE2后，只需要更小剂量的化疗药物就可以杀死肿瘤细胞。AnnexinⅤ和PI双染提示转染TIPE2后，在相同剂量的CDDP作用下，肿瘤细胞凋亡率明显增多。TIPE2分子是AP- 1的直接抑制分子，而AP- 1可激活MDR1的转录表达，AP- 1和MDR1的同时下降，表明 TIPE2可能是通过抑制AP- 1从而导致MDR1表达下调。MDR1/P- gp的主要功能是导致肿瘤细胞中抗肿瘤药物外排增加[13]，是导致多药耐药(MDR)的关键因素[14]。AP- 1家族主要由原癌基因c- Jun和c- Fos组成，它们位于Ras/Raf途径的下游，对细胞增殖、肿瘤发生、转移和多药耐药至关重要[15,16]。 据我们所知，MDR1表达需要AP- 1与其启动子的结合，其中c- Jun和c- Fos在调节MDR1中起主要作用。蛋白印迹实验发现，转染TIPE2后，AP- 1明显下调，同时对肿瘤耐药起决定性作用的MDR1蛋白亦明显下降，该结果提示TIPE2的过表达抑制AP- 1蛋白表达，导致MDR1表达水平明显降低，从而引起对化疗药物的敏感性更高。炎症因子例如IL- 6及TNF- α等在肿瘤耐药中发挥重要作用[17]，提示TIPE2作为炎性负调控分子可能在其中也发挥关键作用，本研究发现转染TIPE2然后用CDDP处理后炎性因子较对照组明显降低。AP- 1在炎性因子产生中起决定性作用，本研究结果表明TIPE2可能通过抑制AP- 1进而抑制炎症因子产生，从而间接参与肿瘤耐药形成。

我们的实验首次证实TIPE2蛋白可以增加肿瘤化疗敏感性，为逆转肿瘤多药耐药及增强化疗药物生物学作用、减少化疗药物毒副作用提供了理论可能。

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