长链非编码BANCR通过激活Wnt/β- catenin信号通路调控黑色素瘤细胞迁移和侵袭行为①

杨晓静 孟 玮 徐宏俊 周向昭

(河北北方学院附属第一医院皮肤科,张家口 075000)

黑色素瘤也称为恶性黑色素瘤，是一种从黑色素细胞发展而来的癌症[1]。黑色素瘤常见于15～45岁的中青年人，通常发生于皮肤，但偶尔也会出现在口腔、肠道或眼睛[2]。尽管黑色素瘤仅占皮肤恶性肿瘤中4%，但皮肤癌中80%的死亡却是由其所造成[3]。黑色素瘤的主要特征是病情进展迅速，而且现有的治疗效果不理想，患者很快就出现局部淋巴结或者远处器官的转移[4]。因此，进一步深入探寻黑色素瘤的发病机制，寻找新的分子靶点显得尤为重要。

最近，越来越多的人注意到一类称为长链非编码RNA(lncRNA)的基因产物，它在多种肿瘤的发病和发展中起到重要的作用[5]。lncRNA的长度一般大于200个核苷酸，可在不同生物行为过程中调节基因的转录或转录后的表达[6]。有证据表明，lncRNA参与了细胞的凋亡和侵袭，能重塑干细胞的多功能性，调节选择性剪接、染色质重塑和RNA的代谢等[7]。例如，lncRNA HOTAIR能通过增强PRC2调节肿瘤侵袭性，抑制肿瘤的迁徙[8]。而lncRNA H19的高表达与胃癌的发生和转移密切相关[9]。 PRNCR1和PCGEM1可以调节前列腺癌患者体内雄激素受体的转录和表达[10]。

BRAF基因激活的非编码RNA(BRAF- activated non- coding RNA，BANCR)是位于9号染色体上一个693 bp的 lncRNA，在多种癌症中有异常的表达，如结肠直肠癌、视网膜母细胞瘤、甲状腺乳头状癌、肺癌、胃癌和肝细胞癌等[11- 16]。

我们期望通过研究BANCR在黑色素瘤患者中的表达水平，探究BANCR对黑色素瘤细胞侵袭和迁移能力的影响及其调控机制，挖掘新的分子标记物，为黑色素瘤的诊治提供新的方向。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织样品采集 收集从2007年1月到2011年1月之间在我院进行的黑色素瘤切除手术的肿瘤组织109例，正常皮肤组织30例。黑色素瘤患者男性58例，女性51例，年龄40～76岁，中位年龄61岁。本研究通过医院的医学伦理委员会的同意。黑色素瘤组织经过了医院病理科组织病理学的证实。切除的肿瘤组织样本立即放入液氮中冷冻并储存在-80℃直至RNA提取。

1.1.2细胞株和实验试剂 黑色素瘤细胞系A101D、A375、B16均购于武汉大学细胞典藏中心。RPMI1640培养液、10%新生小牛血清(FBS)、含100 μg/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的、0.25%胰酶溶液购自Gibco公司,二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。细胞在含有10%FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中培养，37℃在5%CO2培养箱中培养，生长至80%左右浓度时进行传代和冻存，用于后续的实验。细胞培养瓶和96孔板购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2方法

1.2.1生存分析 使用Kaplan- Meier生存曲线与Log- rank检验对黑色素瘤患者进行生存分析。所有治疗结束后，对患者生存预后情况进行定期随访(门诊随访或电话随访邀请患者定期来院复查)，随访截止时间为2017年3月。生存时间(Suivival time)作为计算患者肿瘤相关生存情况的指标，其定义为从患者初始治疗至患者死亡的时间。

1.2.2细胞转染 实验使用siRNA转染诱导BANCR在细胞中的低表达。BANCR siRNA购于上海Genepharma公司，靶序列如下siRNA59- CGGAAATAGACTGCAGCACCAA- 39。并根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsb- ad，CA)将其转染入细胞48 h，获得相应稳定表达的细胞株。

1.2.3mRNA提取和qPCR试验 吉玛基因有限公司设计BANCR引物，forward:ACAGGACTCCATGGCAAACG,reverse:ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT;GAPDH:forward:ACCACAGTCCATGCCATCAC,reve- rse:TCCACCACCCTGTTGCTGTA。EP管中加入700 μl 的lysis buffer。细胞直接收集好后加入其中裂解。Trozel(Gibco)抽提组织总RNA，逆转录，PCR扩增BANCR，用GAPDH作为内参物。反应条件：以100 ng总RNA为模板，逆转录cDNA，反应条件为：37℃ 15 min，95℃ 5 min。后根据Kapa PCR试剂盒说明书进行PCR反应。获得数据以RQ=2-ΔΔCT计算mRNA表达量。实验重复3次。

1.2.4Western blot检测蛋白水平 实验分为两组:NC组和BANCR- siRNA组，NC组是未做处理的黑色素瘤A375细胞株，BANCR- siRNA是转染慢病毒后的A375细胞株。按照说明书配制10%SDS- PAGE分离胶，每孔加入20 μg蛋白样品。使用湿转法将蛋白至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，TBST充分冲洗后，使用1∶1 000稀释一抗孵育(兔单克隆β- catenin和c- myc抗体)，4℃过夜；加入辣根过氧化酶物标记羊抗兔IgG(1∶2 500)稀释，室温孵育2 h；ECL发光。实验重复3次。

1.2.5划痕愈合实验检测黑素瘤细胞的迁移能力 将两组细胞接种于6孔板，待细胞融合度生长在90%时，用200 μl消毒枪头垂直划线，并在显微镜下测量划痕的初始距离(0 time)，在恒温孵箱中孵育72 h后，测量划痕的距离，并计算细胞的迁移率。细胞迁移率=[D(t=24 h，48 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。实验重复3次。

1.2.6Transwell侵袭实验检测黑素瘤细胞的侵袭能力 所有试剂及器材均于冰块上预冷处理，将Transwell小室置于24孔板内，将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶100 μl，37℃孵育20 min，逐步消化、离心、计数细胞后，按照2.5×104ml-1用无血清培养基将两组细胞稀释，制成细胞悬液；按照每孔200 μl的细胞悬液加入Transwell上室，同时在Transwell下室加入10%FBS+培养基500 μl，放入37℃孵箱培养；孵育24 h后使用甲醛固定细胞，结晶紫染色15 min，使用棉签去除小室内膜上的细胞，然后于显微镜下计数，观察4个高倍视野(×40)下穿过滤膜的细胞数。实验重复3次。

2 结果

2.1BANCR在黑色素瘤组织和细胞株中的表达 使用qPCR检测BANCR在组织标本中和黑色素瘤细胞株中的表达情况。如图1A所示，BANCR在黑色素瘤组织中的mRNA的相对表达量显著高于正常的皮肤组织(3.10±0.44，P<0.05)。如图1B所示，在黑色素瘤细胞株A101D、A375、B16中，BANCR的表达均高于正常对照(P<0.05)，而A375细胞的表达最高(3.23±0.14)，且几种黑色素瘤的生长速度、侵袭及迁移能力相差不明显，所以我们选择A375细胞进行下一步功能学实验。

2.2BANCR与黑色素瘤患者临床病理特征之间的关系 将109例黑色素瘤肿瘤组织样本和癌旁正常组织进行临床病理参数的统计分析。结果发现(如表1所示)，BANCR在不同年龄性别的黑色素瘤患者之间的表达差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。BANCR的表达与黑色素瘤的病理分期及淋巴结是否转移有关，病理分期越高，BANCR在黑色素瘤组织中表达也就越高(P<0.05)，而在有淋巴结转移的患者中BANCR的表达也明显高于未转移的患者(P<0.05)。

2.3BANCR与黑色素瘤患者生存时间的关系 为了探究BANCR对于黑色素瘤患者的预后价值，使用Kaplan- Meier生存曲线与Log- rank检验分析不同BANCR水平的生存时间差异。如图2所示，BANCR高表达黑色素瘤患者的总生存期显著低于BANCR低表达者(P<0.01)。BANCR的表达与黑色素瘤患者的生存时间呈负相关。

图1 BANCR在组织标本和黑色素瘤细胞株中的表达Fig.1 Expression of BANCR in different tissues and melanoma cell linesNote: *.P<0.05.

表1BANCR的表达与黑色素瘤患者临床病理特征之间的关系

Tab.1RelationshipbetweenexpressionofBANCRandclinicopathologicalfeaturesofmelanomapatients

ClinicopathologicaldataNumberHighexpressionofBANCRLowexpressionofBANCRχ2valuePvalueGender1.5720.210Male583226Female512229Age(years)0.0050.944≤6043271660664125Pathologicalstaging10.4580.015Ⅰ1275Ⅱ211011Ⅲ594613Ⅳ17152Lymphnodemetastasis11.4500.001No351817Yes746113

图2 BANCR与黑色素瘤患者生存时间的关系Fig.2 Relationship between survival time of BANCR and melanoma patients

图3 BANCR对A375细胞侵袭能力的影响Fig.3 Effects of BANCR on invasion ability of A375 cellsNote: *.P<0.05.

2.4BANCR对A375细胞侵袭能力的影响 使用siRNA将A375的BANCR进行下调。Transwell实验结果如图3所示，BANCR- siRNA组通过Matrigel基质胶的细胞数量为(98.54±5.21)，明显少于对照组(423.34±10.72)，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果说明抑制BANCR的表达可以减弱A375细胞的侵袭能力。

2.5BANCR对A375细胞迁移能力的影响 划痕愈合实验结果如图4所示，在荧光显微镜下观察测量两组细胞任意三个部位的划痕宽度，计算相应的迁移率，公式如下：迁移率=[D(t=24 h，48 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。结果表明，BANCR- siRNA组细胞的迁移速率明显低于对照组，两组在24 h和 48 h 的迁移率分别为(25.61±7.37)% vs (46.92±9.48)%,P<0.05；(31.25±12.75)% vs (72.19±12.23)%,P<0.05。A375细胞的迁移能力随BANCR的表达降低而降低。

2.6下调BANCR后对Wnt/β- catenin信号通路的影响 Western blot结果显示(图5)：与NC组相比，BANCR- siRNA组中β- catenin和c- myc蛋白表达水平明显下降[(1.25±0.18)vs (2.45±0.09);(1.34±0.23)vs (3.17±0.11),P<0.05]；表明下调BANCR可以影响Wnt/β- catenin信号通路的表达。

图4 BANCR对A375细胞迁移能力的影响Fig.4 Effects of BANCR on migration ability of A375 cellsNote: *.P<0.05.

图5 BANCR对β- catenin和c- myc蛋白表达水平的影响Fig.5 Effect of BANCR on protein expression levels of β- catenin and c- mycNote: *.P<0.05.

3 讨论

黑色素瘤的主要原因是紫外线暴露于皮肤色素含量较低的人群，通常白人的发病率高于其他有色人种[17]，而且黑色素瘤的发病风险随着年龄的增长而增加，诊断时的平均年龄约为60岁[18]。在全球范围内，2012年新发的黑色素瘤约有23.2万人，2015年有310万患有活动性疾病，导致59 800人死亡[19]。来自欧洲，加拿大和美国的流行病学数据显示，过去几十年黑色素瘤的发病率持续增长[20]。新西兰发病率最高，每10万人50例[21]。

对于早期的黑色素瘤，活检确诊后，通常进行广泛的肿瘤切除[22]。除此之外，还可以根据患者的病理分期，选择性地采取前哨淋巴结活检[23]。而对于晚期黑色素瘤的治疗则是从多学科的方法进行的。近年来随着靶向治疗的发展，黑色素瘤患者的生存预后有着显著的改善[24]。特别是免疫疗法已经成为除了手术，化疗和放射治疗之外，治疗转移性黑色素瘤的主要方式[25]。2011年6月，一项由ipilimu- mab与达卡巴嗪联合治疗晚期黑色素瘤的临床试验表明，患者的中位生存期从9个月增加到11个月[26]。尽管生存时间有所改善，但与我们预期的仍有一定距离。所以对于黑色素瘤患者，特别是晚期的患者，我们仍需要继续寻找更高效的治疗靶点。

BANCR最早是由Nicola和Ross通过RNA- seq对致癌基因BRAFV600E表达影响的转录物进行筛选而首次被发现[27]。Guo等[11]研究表明显示，BAN CR在结肠直肠癌中高度表达，BANCR表达增加与临床分期和淋巴结转移相关。此外，BANCR通过MEK/ERK途径诱导上皮间质转化来促进子宫内膜癌的迁移[28]。而在胃癌中，BANCR通过灭活P38和JNK MAPK促进癌细胞的增殖和迁移，而高BANCR水平与临床分期，肿瘤深度，淋巴结和远处转移、预后呈正相关[15]。BANCR表达增加还是视网膜母细胞瘤患者预后差的独立危险因素，BANCR的下调显著抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移和体外侵袭[12]。我们的结果也证实，BANCR与黑色素瘤的迁移能力和侵袭能力密切相关。而且BANCR的表达与黑色素瘤患者的临床病理特征也存在一定联系，淋巴结转移和较高的病理分期往往都存在有高表达的BANCR。患者的生存时间也随BANCR的升高而降低。

Wnt信号通路对黑色素细胞的发育至关重要，它可以指导黑色素细胞迁移到表皮和毛囊，并促进其分化，有助于皮肤毛发的色素形成[29]。而Wnt信号通路蛋白过量表达会导致黑色素细胞数量的增加。相反，Wnt- 1和Wnt- 3a基因的缺失会导致Wnt信号活性的丧失，从而导致黑色素细胞的减少[30]。

蛋白质Wnt家族可以通过三个关键介质介导的三种不同途径发出信号：β- 连环蛋白(典型的Wnt信号通路)，JNK(平面细胞极性通路)和PKC /Ca2+(非典型的Wnt信号通路)[31]。事实上越来越多的证据表明，黑色素瘤中Wnt调节的二分体表型归因于由不同Wnt家族成员刺激的典型和非典型轴之间的相互作用[32]。按照目前的理解是，黑色素瘤细胞的生长和转化是通过典型的Wnt信号通路，而转移则通过非典型Wnt信号通路[33]。我们的研究也发现下调BANCR后，对Wnt/β- catenin信号通路起到一定的抑制作用，下游的β- catenin和c- myc表达明显降低。

综上所述，长链非编码BANCR在黑色素瘤患者中普遍存在高表达，而且与患者生存时间呈负相关，同时它也能通过激活Wnt/β- catenin信号通路调控黑色素瘤细胞迁移和侵袭行为。

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