寨卡病毒动物感染模型研究进展

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1947年，寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)首次分离于乌干达寨卡森林中的猕猴体内，隶属黄病毒科黄病毒属。1952年尼日利亚出现首例人感染寨卡病毒的报道[1-2]。2007年以前的寨卡病毒感染具有散发与自限性，发病通常局限于少数亚非国家，同其它黄病毒如登革病毒等相似，多数感染呈一过性，仅少数ZIKV患者会伴发发热、头疼、皮疹、关节疼痛与结膜炎等轻微临诊症状[2]。2007年西太平洋密克罗尼西亚联邦Yap岛暴发寨卡疫情，其中49人确诊，59人疑似感染[3]。2015年寨卡病毒“登陆”南美洲，其中巴西疫情最为严重，有数百万人感染寨卡病毒，并出现死亡病例[4]。2016年2月，我国确诊第一例寨卡病毒输入性感染病例，同期日本与韩国等地也先后报道寨卡感染病例，至此寨卡疫情全球渗透[5]。随着寨卡疫情的蔓延与寨卡病毒研究的深入，科学家们发现近年来暴发的强致病性ZIKV分离株可损伤人类中枢神经系统，诱发新生儿小头症、重症脑部发育缺陷、脑膜脑炎、急性脊髓炎、免疫系统相关的吉兰巴雷综合征以及先天性寨卡感染综合征(Congenital Zika syndrome, CZS)等[6-7]。2015年7月至2016年12月，仅巴西就有2000余例新生婴儿感染寨卡病毒导致小头畸形症[7-8]。ZIKV感染引起的不同以往的脑组织损伤症状引发全球高度关注，2016年2月1日世界卫生组织宣布寨卡疫情为全球紧急公共卫生事件[9]。

寨卡病毒属于虫媒病毒，其主要的传播媒介是埃及伊蚊与白纹伊蚊。携带寨卡病毒的伊蚊叮咬人类后促成寨卡病毒的传播，该传播途径与伊蚊的季节性及区域性分布密切有关[1]。不同与其它黄病毒的是已有大量研究发现ZIKV还可以通过血液-胎盘、泪液、性和母婴等非蚊媒载体途径进行传播，这使得防控寨卡病毒传染的难度更大[10]。目前全球尚无安全有效防治寨卡病毒感染的疫苗和特异性抗ZIKV药物。ZIKV病原流行病学监测、媒介控制以及对患者与易感人员的有效隔离仍然是目前最主要的预防措施。寨卡病毒为单股正链RNA病毒，基因组长度约为11 kb，病毒颗粒呈球形，有包膜。现有的寨卡病毒至少可分为2个主要的遗传谱系：非洲谱系和亚洲谱系。ZIKV基因组仅有1个开放阅读框(ORF)，ORF两侧的5′UTR与3′UTR内高度保守的二级结构区域对病毒基因组的翻译与复制起辅助作用。该阅读框编码一个多聚体蛋白，加工成熟后可形成3个结构蛋白(衣壳蛋白C、前体膜蛋白prM与囊膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)。各个蛋白在病毒的吸附、入侵、翻译、复制与组装等感染过程中扮演重要作用[2,10]。

良好的动物模型是研究寨卡病毒感染传播机制、筛选抗病毒药物与评估候选疫苗效力的重要一环，也是寨卡病毒感染生物学研究的热门领域之一[8]。国内外目前已报道的各种ZIKV动物感染模型包括野生小鼠、免疫缺陷小鼠、豚鼠、鸡胚与猕猴模型。

1 寨卡病毒小鼠感染模型

小鼠因其具有体型小，易于饲喂，实验管理条件易于控制，操作相对简便等特点，一直是多种疾病理想的常见实验动物模型。ZIKV动物感染模型中以小鼠研究最多[8]。乌干达分离的第一株ZIKV(MR 766)，已于小鼠脑内连续传代100余次，较大剂量脑内接种该毒株可引起哺乳期小鼠神经系统疾病，但外周途径接种时并不会引起成年野生近交或远交小鼠发病。反复传代蓄积的病毒多位点变异引起的毒株对宿主细胞嗜性的改变，可能直接导致了MR766毒株致病性的降低[8]。因此，学界认为以近年来ZIKV流行区域分离的寨卡病毒流行株进行小鼠感染模型再评估将更有意义[1, 8]。目前小鼠感染模型主要包括以下几类：

1.1新生幼鼠感染模型 由于非洲型或亚洲型ZIKV临床分离株外周途径接种成年野生鼠(包括C57BL/6、BALB/c与CD-1)后没有引起典型的临床表征，脏器中也检测不到ZIKV粒子或RNA，因此有学者采用新生幼鼠进行寨卡病毒感染试验[8]。Fernandes等[11]将ZIKV巴西分离株SPH 2015分别脑内或皮下接种1日龄新生Swiss小鼠，结果显示两种方式感染的小鼠均出现不同程度的嗜睡、共济失调和麻痹等神经症状，且脑内感染小鼠病程更急，症状更为凶险；病理组织观察ZIKV感染的新生幼鼠发现脑神经元细胞变性、凋亡，脑血管周边白细胞浸润，急性星型胶质细胞增生，神经胶质纤维酸性蛋白大量表达等特征。Manangeeswaran等[12]以ZIKV波多黎各毒株PRVABC59皮下接种1日龄的野生型C57BL/6小鼠，感染后2周左右发现小鼠出现震颤、严重的共济失调与癫痫等神经症状，免疫病理学分析显示ZIKV主要聚积于小鼠小脑区域，相应区域的脑神经细胞变性，脑组织CD8+T细胞浸润，上述结果为进一步佐证ZIKV感染与脑组织损伤的相关性提供了试验依据。

1.2免疫缺陷小鼠感染模型 Grant A等[13]研究发现寨卡病毒可通过NS5蛋白降解人I型干扰素受体(IFNAR1)活化关键转录因子STAT2以拮抗人I型干扰素的产生与反应，但该病毒的NS5蛋白并不结合或促成小鼠STAT2的降解，这可能是免疫完整的野生小鼠对ZIKV感染和疾病发生具有抗性的主要原因。已有研究发现I型干扰素分泌缺陷的转基因小鼠可以作为其它黄病毒感染的动物模型[14]，由此启发众多学者采用干扰素受体先天缺陷的转基因小鼠进行ZIKV感染模型的评估。

Dowall等[15]模拟蚊虫叮咬方式对5～6周龄IFNAR1-/-缺陷小鼠A129后腿皮下接种ZIKV，结果发现A129小鼠感染ZIKV后发病严重，6 d内死亡率达100%，在血液、脑组织、脾脏、肝脏和卵巢中均可检测到大量的寨卡病毒RNA，感染ZIKV的A129小鼠脑组织与脾脏细胞出现凋亡坏死，有明显的炎性细胞浸润，而接种ZIKV的129Sv/Ev野生型小鼠尽管在血液、脾脏和卵巢中检测到极小量的病毒RNA，但并未表现出临床症状或观察到病理学变化。Rossi等[16]对不同生长阶段的A129小鼠皮下接种传代次数较低的亚洲谱系ZIKV毒株(FSS13025)时发现A129小鼠对该毒株易感，且A129小鼠致死率与其感染年龄有关，其中3周龄小鼠感染后死亡率达100%，5周龄达50%，11周龄的A129小鼠感染后不死亡(0%)，但伴随严重的病毒血症与体重减轻等临床症状。先天缺陷I型和II型干扰素受体的AG129小鼠对ZIKV更为易感，临床症状更为明显，如：Aliota等[14]报道接种亚洲株ZIKV(H/PF/2013)的AG129小鼠在8 d内全部死亡，其中幼龄AG129小鼠病程更短更急，内脏器官与脑组织中可检出高滴度的ZIKV，小鼠全身病变明显，尤以脑组织和肌肉损伤最为严重。另有研究组构建了3种干扰素转录调节因子(IRF3，IRF5和IRF7)先天缺失的转基因小鼠进行ZIKV感染试验，结果与上述研究类似，三重IRF缺失的小鼠对ZIKV感染极为敏感，病情严重，ZIKV可诱发小鼠中枢神经系统感染并刺激神经祖细胞凋亡[17-18]。

Smith等[19]从免疫学角度采用阻断小鼠IFNAR1的单克隆抗体处理野生型C57BL/6小鼠后感染ZIKV(Dakar 41519毒株)，结果发现抗体处理组的小鼠对ZIKV更为易感，皮下接种小鼠出现40%的死亡，腹腔接种时小鼠发病更为严重，死亡率高达100%，且两种感染途径均可导致小鼠出现体重减轻，严重的病毒血症和典型的神经病理学症状。Tripathi等[20]以I型干扰素通路关键活化分子STAT2缺陷的小鼠作为感染模型，结果发现Stat2-/-小鼠对ZIKV高度敏感，感染后神经症状明显，ZIKV在小鼠中枢神经系统、性腺和其他内脏器官中均有分布，利用该模型作者还发现非洲谱系的ZIKV毒株感染Stat2-/-小鼠病变严重，小鼠病程短而急，死亡率高，而亚洲谱系毒株感染的小鼠病程长，神经功能障碍较缓，个别Stat2-/-小鼠会出现死亡。这可能与非洲谱系的ZIKV毒株诱导Stat2-/-小鼠脑组织表达更高水平的白细胞浸润相关标志物及炎性因子有关。

1.3孕鼠感染模型 寨卡病毒感染孕妇后导致胎儿流产、胎儿小头畸形、生长受限甚至死亡等疾病，对婴幼儿影响极大,建立合适的ZIKV-胎儿感染模型以探索该病毒如何跨越子宫内血胎屏障垂直传播感染胎儿与影响胎儿神经系统发育的机制十分重要[1, 8]。Miner等[21]对受孕的IFNAR1-/-缺陷母鼠在胚胎发育期E6.5或E7.5时模拟叮咬方式皮下接种ZIKV(H/PF/2013)，对应E13.5或E15.5期时发现ZIKV感染后胎儿出现死亡，胎儿体型变小，在胎儿脑部、胎盘及母体内均可检测到高滴度的ZIKV，病理组织学观察发现ZIKV可感染胎盘滋养层与内皮细胞，诱导胎盘血管损伤与脑神经元细胞凋亡等。对IFNAR1抗体处理的野生怀孕母鼠同步进行上述试验，结果显示胎儿未死亡，但ZIKV同样可以感染和损害胎盘，并导致小头畸形和生长受限。Cugola等[22]对正常的野生SJL或C57BL/6孕鼠静脉接种ZIKV巴西株，发现感染ZIKV的SJL孕鼠可引起胎儿宫内生长受限，全身发育延迟，胎儿脑皮质畸形，皮层厚度及神经元细胞减少的现象，这与人感染ZIKV小头症相关表型极为相似。Yockey等[23]对野生C57BL/6孕鼠阴道内接种ZIKV菌株(FSS13025)，结果发现该病毒可在孕鼠阴道黏膜内复制，胎儿脑组织中也可检出ZIKV，感染可引起小鼠胎儿重量减轻，生长受限及溶解等现象，这为ZIKV可能通过性传播提供了证据。Li等[18]直接对野生ICR孕鼠胚胎发育E13.5期的胎儿进行脑室内接种ZIKV(亚洲谱系株SZ01)，结果发现ZIKV可通过调节机体免疫反应，上调表达病毒入侵识别相关受体，在胎儿脑组织内大量复制，通过诱导神经元祖细胞周期停滞、凋亡和分化障碍等环节，最终导致胎儿小头畸形，该研究为寨卡病毒感染影响脑组织的发育提供了直接的试验依据。

2 寨卡病毒豚鼠感染模型

豚鼠因其生殖生理、发情周期及胎盘种类与人类相似，是公认的研究先天性感染与性传播疾病的理想动物模型，因此有希望为研究寨卡病毒母体垂直传播机制及对婴儿神经系统发育影响作参考。Kumar等[24]以ZIKV波多黎各毒株PRVABC59皮下接种野生型豚鼠，结果发现豚鼠感染病毒后主要表现为发热、嗜睡、驼背、皮毛皱褶和运动障碍等临床症状，豚鼠全血、血清、脾脏及脑组织均可检出ZIKV，以脑组织病毒载量最高，ZIKV感染的豚鼠血清中多种细胞因子、趋化因子和生长因子等急剧表达上调。Deng等[25]对成年豚鼠皮下接种委内瑞拉来源的ZIKV GZ01毒株或柬埔寨FSS13025毒株，发现ZIKV可在豚鼠体内复制，感染后2天即可在豚鼠血液、唾液及泪液中检出持续排毒，组织病理与病原学分析发现ZIKV可在豚鼠脾脏、肠道与睾丸中检出，ZIKV可诱导机体产生特异性抗体。研究者还发现直接密切接触也可以促进ZIKV传播，将健康豚鼠与带毒豚鼠混合同笼饲养，直接暴露于ZIKV传染源的健康豚鼠也感染成功。

3 寨卡病毒鸡胚感染模型

Goodfellow等[26]以不同剂量的ZIKV毒株(MEX1-44)羊膜穿刺接种鸡胚，结果显示ZIKV可致鸡胚死亡，并且表现出ZIKV剂量依赖性，未死亡的鸡胚在感染后期出现大脑发育异常，脑组织生长受限，尤其是大脑皮层区域脑心室容积增加明显。该模型为探索寨卡病毒感染引发胎儿发育异常的机制提供了较好的替代动物模型。

4 寨卡病毒猕猴感染模型

猕猴作为非人灵长类动物在胎儿妊娠、胎盘屏障、大脑灰/白质比例及神经系统发育等方面与人类最为相似，相比于其他动物更适合作为寨卡病毒感染研究模型[8]。Dudley等[27]以ZIKV亚洲谱系毒株H/PF/2013分别皮下接种雄性、雌性与怀孕猕猴，结果显示3类猕猴均对ZIKV易感，病毒在猕猴体内繁殖迅速，接种1 d后即可在血液中检出，部分猕猴尿液、唾液及脑脊液中也可检出ZIKV，病毒感染后期可诱导猕猴机体产生病毒特异性T细胞、NK细胞与抗ZIKV中和抗体等，这些免疫保护性反应可抵抗10周后ZIKV攻毒再感染。Osuna等[28]同时分析比较了2株不同ZIKV毒株在恒河猴或短尾猴上的感染情况与不同猕猴对ZIKV感染的宿主免疫防御反应，结果显示不同品种的猕猴对ZIKV易感，ZIKV诱导的机体先天性和适应性免疫应答反应可拮抗病毒复制，促进病毒清除与抵抗二次感染，这与Dudley等的研究结论一致。猕猴还是ZIKV候选疫苗免疫原性与保护效力评价的动物模型[8, 29]。

5 小 结

现有的动物感染试验结果对于了解寨卡病毒感染机理、诱发胎儿小脑症与研发抗ZIKV的疫苗或药物起到了至关重要的作用，但各模型仍有一定的缺陷[1, 8]。如：小鼠模型对ZIKV并不天然易感，往往需要IFN受体缺陷的小鼠或较大剂量的病毒接种才有效，小鼠胎盘结构与免疫系统与人类的又有一定的生理差异，与ZIKV感染相关的人吉兰巴雷综合征症状并未在小鼠模型中得到复现；鸡胚模型与人类遗传关系较远，且ZIKV感染鸡胚的相关研究还不够透彻；灵长类大动物猕猴模型虽然与人类最为相似，试验数据更为可信，但猕猴孕期长、个体差异大、实验材料不易获取与成本昂贵等问题突出。目前国际上尚无完全理想的ZIKV感染与疫苗评估可靠的统一动物模型，如何比较分析不同ZIKV毒株的致病性差异与评估不同动物模型间的感染差异，筛选合适的动物感染模型仍然是下一步研究的重点。

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