猪细小病毒的分离与鉴定

王 璇，吴玙彤，潘淑惠，文正常

（贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005）

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV)）是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一。Cartwright等1967年首次证实了它的致病性[1]。我国候世宽、潘雪珠等分别在黑龙江、上海、四川等地分离出PPV，证明本病在我国存在[2-5]。近年来，由于猪只流通频繁，北京、广西、宁夏及周边地区、河南等地都有猪细小病毒感染报道。

2016年9月，贵州某猪场的139头初产母猪开始产仔，所产的仔猪中有60%发生木乃伊化，30%系死胎。2016年10月，又有28头初产母猪产仔，除去部分木乃伊和死胎以外，共产下274头弱仔，大多数弱仔在产后2～3周内死亡，仅34头仔猪存活，存活率只有12．41%。笔者等根据病毒的分离与鉴定，确诊为猪细小病毒感染所致，现将实验室诊断过程报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

3头流产胎儿，采集自贵州某猪场。

1.1.2 细胞

PK-15传代细胞，购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 试剂

SDS、蛋白酶K、酚/氯仿/异戊 醇、dNTPs、Taq DNA聚 合 酶、D2000 DNA Marker、RNase等 试 剂，购自上海生物工程技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料处理

取种猪场B261、B262、B38初产母猪流产胎儿的肝脏病料，混合后以1∶5的比例加入生理盐水研磨组织匀浆液，青霉素、链霉素双抗处理过夜，反复冻融3次，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min除去组织碎片，取上清液作无菌检查合格后－20 ℃保存备用。

1.2.2 病毒分离培养

采用0．25%胰酶消化分散PK-15单层细胞后，待细胞长满细胞瓶的1/3时，贴壁倾倒瓶内营养液，加入已处理好的病料9 mL。37 ℃吸附1 h（每隔15 min摇一次）后，加入等量的维持液。37 ℃培养3～7 d，待出现细胞病变后，收冻。如3～7 d后还未出现病变，再盲传3代，若无病变则弃之。同时设正常对照细胞。

1.2.3 PCR鉴定

1．2．3．1 引物的设计与合成

采用Moliter等[6]报道的针对猪细小病毒VP2基因的1对引物序列，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为P1：5′－GCAGTACCAATTCATCTTCT－3′；P2：5′－TGGTGTCCTTCTGTGGTAGG－3′，片段大小为158 bp。1．2．3．2 PCR 反应

采用2 m5L 的反应体系：10×PCR buffer（MgCl2Free）2．5 mL、MgCl（22．5 mM）2 mL、dNTP（10 mM）0．5 mL、TaqDNA 聚合酶（2．5 U/ mL ）0．5 mL、P1/P2引 物（10 pM/ mL）各1 mL、病毒DNA模板1 mL，最后用16．5 mL的灭菌双蒸水补至25 mL。

在下述反应条件下进行PCR扩增：95 ℃预变性4 min，然后进行34个循环，95 ℃变性 45 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸10 min。

取PCR产物6mL与溴酚蓝缓冲液2 mL混匀，加样，于1．5%琼脂糖凝胶中电泳，80 V恒压电泳90 min，溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统下观察结果。

1.2.4 病料的检测

临床样品DNA模板的制备：将3头流产胎儿（B261、B262、B38）的肾、脾、脑、肝等充分研磨后，用1：5的生理盐水稀释，－20 ℃反复冻融3次，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min后。按SDS-proteinaseK法提取病料核酸样本。

2 结果

2.1 猪细小病毒的分离

从 3份 病 料 中（B261、B262、B38）分离到1株猪细小病毒，命名为贵州PPV。病毒在PK-15传代细胞上传代后均能出现细胞病变，接毒2～4 d后可明显见到规律性的细胞病变（C PE）；细胞浆出现弥散性颗粒，病变细胞变圆，聚集成簇，呈现拉网状；96～120 h，这种灶性细胞病变由疏散状态发展为密布整个培养瓶；144 h以后，病变的细胞逐渐脱落、上浮。在观察期间，正常对照细胞生长良好，未出现异常反应。

2.2 病料的检测

采用P1、P2引物对临床上3头流产胎儿的不同组织进行了PCR扩增，结果在3头流产胎儿的不同组织均检测到了PPV。不同组织间并没有明显差异。说明PPV在流产胎儿体内没有特别的组织和器官嗜性。

3 讨论

1)根据病毒的分离培养特性，结合PCR鉴定，可以判定病料中分离到的病原是猪细小病毒，贵州省某猪场发生的是猪细小病毒感染。

2)本次实验利用阳性病料经处理后在PK-15传代细胞上培养，分离出了一株猪细小病毒，此病毒能够在PK-15细胞上适应生长并引起明显的细胞病变。据文献报道，PPV的增殖必须依赖细胞的生长周期，因此要获得大量的病毒并出现明显的细胞病变，PPV接种的时机非常关键，要求在多数细胞处于旺盛的细胞有丝分裂期进行病毒接种，而不像一般常规那样，待细胞形成单层后才能接种。因此，待细胞长满细胞瓶的1/3时接种为佳。

3)Moliter等根据PPV基因组序列设计了扩增VP2基因中158 bp片段的1对引物，成功地建立了PPV的PCR检测方法。但是该方法有一个明显的不足之处，由于扩增的片段只有158 bp，在检测临床样本时，该扩增产物的大小和PCR反应中经常出现非特异引物二聚体相近，极易造成结果的误判。

4)本实验用PCR方法对3头流产胎儿的不同组织进行检测，在3头胎儿的不同脏器均可检测到PPV。不同组织间并未见明显的差异，说明PPV在流产胎儿体内没有特别的组织和器官嗜性，检测的结果和文献报道检测的结果一致。

[1] C A R T W R I G H T F，H U C K R A． Viruses isolated in association with herd， inifertility， abrotions and stillbirths in pigs[J]．Vet．Rec，1967，61：196-197．

[2] 侯世宽，江曙光，孙恩贵，等．猪细小病毒Mu--1株的分离和鉴定[J]．兽医大学学报 ， 1983，3(4)：321-328．

[3] 潘雪珠，刘洪云，严仲烈，等．猪细小病毒S--1毒株的分离和鉴定[J]．上海畜牧兽医通讯 ，1983(1)：1-3．

[4] 潘雪珠，严仲烈， 唐骐骏，等．猪细小病毒S--1毒株的分离和鉴定(二)[J]．上海南牧兽医通讯，1984(1)：5-8．

[5] 邬捷，曹国文，乔代蓉，等．秋季初产母猪死胎病毒病原的分离和鉴定[J]．西南农业学报 ，1985(2)：63-69．

[6] MOLITOR T W，ORAVCCRAKUL K，HANG Q，et al． Polymorase chain reaction(PCR) aplification for the detcction of porcine parvovirus[J]．J VirolMcthods，1991，32(2-3)：201-211．