氧乐果导致染毒大鼠内质网应激的研究

刘霖霖，庄传宁，熊书晗，孟繁竹，吴秀丽

(1.吉林大学公共卫生学院，吉林 长春130021；2.吉林大学公共卫生学院劳动与环境卫生教研室，吉林 长春130021；3.吉林大学基础医学院分子生物学教研室，吉林 长春130021)

糖尿病对人类健康有着严重危害，寻找到有效的预防治疗措施已经成为全世界医学领域研究工作者的共同目标，预计到2030年糖尿病患者将达到3.6亿[1]。糖尿病的主要危险因素有环境因素，遗传因素和生活方式等。流行病学调查资料显示，有机磷农药的暴露接触可以提高糖尿病的患病率与死亡率[2,3]。有机磷急性中毒的患者会出现短时间的尿糖并且伴有高血糖症[4,5]，其作用机制可能是导致体内产生氧化应激和内质网应激，从而引起骨骼肌胰岛素信号传导路径变化。本研究选用氧乐果作为染毒剂，对大鼠持续60天的经口染毒，检测大鼠骨骼肌内的PERK，BiP，p-eIF2α，eIF2α，IRE1α的表达情况，探讨氧乐果对大鼠内质网的影响。

1 实验对象与实验方法

1.1实验对象

1.1.1实验动物 40只8周的Wistar雄性大鼠，体重185±15 g，购于北京华阜康生物技术有限公司。

1.1.2试剂 氧乐果乳油购于江苏华隆化工有限公司、抗体(PERK抗体、p-eIF2α抗体、IRE-α 抗体、eIF2α抗体、BiP 抗体 )购于美国CST公司。

1.2实验方法

1.2.1实验动物的分组与处理 将大鼠随机分为4组，即对照组(Control)，高剂量组(HD)，中剂量组(MD)和低剂量组(LD)。每组10只，用苦味酸进行编号。有机磷是氧乐果乳油(浓度为40%)。灌胃量为0.40 ml/Kg体重，对照组用生理盐水灌胃，染毒组分别用不同浓度的氧乐果乳油。自由饮食、饮水，每3天对大鼠进行称重，并重新计算给药量，持续2个月。

1.2.2Western Blot方法检测蛋白表达水平 按照常规方法进行蛋白电泳，转膜后，加入一抗(PERK抗体、p-eIF2α抗体、IRE-α 抗体 、eIF2α抗体、BiP 抗体，1∶1 000稀释)，5%脱脂牛奶封闭，室温摇床上孵育1 h后4℃过夜。洗膜后，加入二抗，1∶2 000稀释。室温轻摇45 min，洗膜显影后，使用Quantity One软件对结果进行分析。

2 结果

2.1氧乐果染毒对大鼠骨骼肌中BiP表达水平的影响

染毒组BiP的表达水平均高于Control组(P<0.05)。LD组BiP的表达水平低于MD和HD组(P<0.05)；MD组BiP的表达水平低于HD组(P<0.05)。各组中BiP表达水平与比较如图1-图2所示。

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD；△P<0.05 vs.MD

图2 不同染毒剂量组大鼠骨骼肌中BiP水平比较

2.2氧乐果染毒对大鼠骨骼肌中PERK表达水平的影响

染毒组PERK的表达水平均高于Control组(P<0.05)。LD组PERK的表达水平低于MD和HD组(P<0.05)；MD组PERK的表达水平低于HD组(P<0.05)。各组中PERK的表达水平与比较如图3-图4所示。

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD；△P<0.05 vs.MD

图4 不同染毒剂量组大鼠骨骼肌中PERK水平比较

2.3氧乐果染毒对大鼠骨骼肌中IRE1α表达水平的影响

染毒组IRE1α的表达水平均高于Control组(P<0.05)。LD组IRE1α的表达水平低于MD和HD组(P<0.05)；MD组IRE1α的表达水平低于HD组(P<0.05)。各组中IRE1α的表达水平与比较如图5-图6所示。

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD；△P<0.05 vs.MD

图6 不同染毒剂量组大鼠骨骼肌中IRE1α水平比较

2.4氧乐果染毒对大鼠骨骼肌中p-eIF2α和eIF2α表达水平的影响

经60天染毒，检测各组中p-eIF2α和eIF2α的表达情况。染毒组p-eIF2α和eIF2α的表达水平均高于Control组(P<0.05)。LD与MD两组间的p-eIF2α和eIF2α表达水平差异不具有统计学意义(P>0.05)； LD组与MD组的p-eIF2α和eIF2α的表达水平低于HD组(P<0.05)。

各组间的p-eIF2α在总eIF2α所占比例存在差异具有统计学意义(P<0.05)。染毒组p-eIF2α/eIF2α水平均高于Control组(P<0.05)。LD与MD组p-eIF2α/eIF2α的表达水平差异不具有统计学意义(P>0.05)；LD组和MD组p-eIF2α/eIF2α的表达水平低于HD组(P<0.05)。各组中p-eIF2α和eIF2α表达水平及比较如图7-10所示。

3 讨论

随着社会的发展和进步，人们生活节奏的加快，生活环境的改变以及医疗技术水平的提高，人类的疾病谱中慢性非传染性疾病逐渐取代传染性疾病占主导地位。据调查显示全球范围内有将近3.5亿人的健康受到糖尿病的危害。糖尿病是一种由多种原因引起的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病，其临床表现为“三多一少”，即多饮，多食，多尿，消瘦。而且环境因素、遗传因素、肥胖、营养因素、生理因素、社会环境因素和体力活动缺乏等都是糖尿病发生发展的危险因素。流行病学调查显示长期的暴露于有机污染物可能促进糖尿病的发生发展。有机磷和有机氯农药是我们日常生活中最常见和最常接触的两种有机污染物。有的研究推测机体产生的胰岛素抵抗或高血糖症可能是由于经常暴露于大量使用有机磷的农药的环境所引起，关于这样的说法有的研究者予以否认。研究对象接触的农药的种类、暴露途径、暴露剂量不同等因素可能都会导致最终结果的不一致。氧乐果作为一种高毒，高效且不易产生抗性的有机磷农药，在一些发展中国家被大量使用。当蔬菜水果中含有大量农药残留，人们可因长期食用这些被污染的食物而持续暴露于有机物污染的环境中。本研究采用对大鼠持续60天的氧乐果经口染毒，检测骨骼肌内的PERK，BiP，p-eIF2α，eIF2α，IRE1α的表达情况，对氧乐果对大鼠内质网的影响和作用机制进行初步的探讨。

图7 不同染毒剂量组大鼠骨骼肌中p-eIF2α和eIF2α的表达

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD

*P<0.05 vs.Control；#P<0.05 vs.LD

研究显示大鼠处于有机磷暴露接触状态下机体可以产生内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)，内质网在机体内主要的功能是负责细胞内蛋白空间结构，多肽链的折叠和修饰功能。内质网稳态被打破造成蛋白发生折叠的错误和障碍，细胞内未折叠和错误折叠蛋白的累积引起ERS[6,7]。内质网通过激活包内信号转导来反应腔内未折叠蛋白的压力，这统称为未折叠蛋白反应(UPR)。而且，至少三种明显不同的UPR通路来调节各种不同基因的表达使内质网保持稳态或当内质网应激得不到消除时诱导细胞凋亡。UPR的三条主要途径包括PERK-eIF2α，IRE1α以及ATF6[8,9]。内质网膜上的跨膜蛋白有IRE1α，PERK和ATF6等。BiP(GRP78)蛋白是内质网上一种对于维持细胞正常活性非常重要的钙离子结合分子伴侣。正常情况跨膜蛋白与分子伴侣蛋白BiP(GRP78)稳定结合。当网腔中有异常蛋白质堆积时，或者机体受外界各种有害因素的刺激打破了细胞内钙平衡。与钙离子结合的分子伴侣BiP会与内质网中的异常蛋白结合，引起下游相应的信号反应。Bip对于维持细胞稳态和防止细胞凋亡具有重要作用。当PERK与BiP分离后，PERK通路可以使eIF2α磷酸化，抑制蛋白质的翻译与合成。为避免异常蛋白的积聚，BiP会阻截并与其结合，还可以保证蛋白的糖基化正常进行和促进蛋白正确折叠，从而达到减轻ERS的目的[10]。本实验结果证明，3组大鼠经过氧乐果60天染毒后，与Control组相比，染毒组每组中BiP，PERK和IRE1α的表达水平均显著升高，这可以证明经过氧乐果染毒刺激后大鼠体内能够产生ERS反应。到目前为止，关于有机磷农药的暴露接触能否引起机体产生内质网应激及其作用机制的研究相对较少。李兰[11]研究发现用对氧磷处理的细胞也产生了ERS。Hajnocz-ky等[12]的研究结果也表明有机磷能够导致ERS。

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