中性粒细胞胞外诱捕网研究最新进展

崔 蕊,方 玲,谢 风

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

中性粒细胞是机体的免疫防御系统中的一条非常重要的防线，它参与机体的免疫反应主要是在病原体感染时，通过吞噬、脱颗粒来抵抗侵袭，形成吞噬体后，在内部通过NADPH[1]形成具有高浓度的活性氧(reactive ox-ygen species,ROS)和抗菌蛋白可以用来杀灭病原微生物，而在2004年，Brinkmann等[2]首次研究证明，当受到病原体刺激后，中性粒细胞可以将颗粒蛋白和去致密化染色质排除细胞外，从而捕获并杀死病原微生物，并将这一免疫过程称为中性粒细胞胞外诱捕。在2007年，Steinberg和Grinstein[3]将中性粒细胞这种被发现介于坏死和凋亡的死亡方式称为：NETosis(Neutrophil Extracellular Traps)。NETosis被认为是一种中性粒细胞免疫应答的新方式[4]。同时我们发现，NETs不仅被认为是一种全新的免疫方式，当NETs的形成与清除不能达平衡，或结构异常时，则参与多种自身免疫病[5]，同时，经试验证明NETs与血栓形成、动脉粥样硬化，甚至肿瘤转移都有密切关系。

1 NETs的形成及构成

从形态学的角度 ，NETosis的主要特点是①颗粒的获得②核结构的改变。它是一个完全不同于坏死和凋亡的程序性死亡的过程。在NETs的形成过程中有一些酶也起到很重要的作用，如NADPH过氧化物酶、细胞内蛋白激酶 C和活性氧[6]等。但是，目前也有观点认为：研究证明[7]：NETosis产生过程有两种不同的机制：因为刺激而自我杀死性质的NETosis以及因为活性细胞产生的NETosis。NETs是有解聚的DNA以及细胞蛋白构成，主要由24种分别来自细胞颗粒、胞浆、胞核，组蛋白质量比约占70%。电镜下可见，纤维网的基本骨架是直径约为17 nm的染色质(组蛋白与DNA)，镶嵌着直径约为50 nm颗粒蛋白等颗粒状物质[8]，NETs成型以后可以以线性、网状、膜状等各种形态围绕在中性粒细胞的周围，或者以片状、棉絮等形状游离在血液、肺泡腔等，可见其形态可以受空间血流等影响[9]，研究证明[10-12]，巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞也可产生网状结构，在体内发挥一定的免疫作用。

2 NETs的免疫原性

宿主来源或者某些外源的物质如细菌、真菌等均可以刺激中性粒细胞产生NETs[13]，比如：12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇可以在短时间内诱导产生NETs，因此，它是体外实验常用到的NETs体外引物。血清淀粉样蛋白A也可以诱导NETs形成[14]，一些炎性介质也可以诱导NETs的生成[15]。在引物诱导下，蛋白激酶C在活化后可以通过丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 /丝裂素活化蛋白激酶激酶 /细胞外的信号调节激酶信号通路磷酸化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，生成 NETs 形成所需ROS。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等经一系列酶促反应生成超氧化氧离子、过氧化氢(H2O2) 、次 氯酸( HOCl)等。HOCl是刺激 NETs 释放的关键ROS成分[16]。ROS和自噬影响下的染色体解聚是NETs形成的特征之一。NE、精氨酸脱亚胺酶 4( peptidylarginine deiminase type 4 PAD4 )和髓过氧化物酶( myeloperoxidase，MPO )共同参与这一过程，尤其PAD4可催化 3 /4 的精氨酸残基瓜氨酸化，从而减弱静电吸引，造成组蛋白结合DNA的能力下降[17]。而NET的抗菌策略主要可以分为①将表面带有正电荷的病原体捕获，限制其扩散[18]。②NETs内含有抗菌酶及组蛋白可以杀伤病原体。③NETs内部含有的NE可分解沙门菌等细菌的毒力因子。

3 NETs与临床疾病

3.1NETs与感染

当机体受到病原微生物侵害时，因为巨噬细胞等分泌的炎性因子，导致中性粒细胞大量聚集在感染部位，分泌形成NETs结构中富含的组蛋白、蛋白肽和抗菌肽等，其杀伤力强于中性粒细胞吞噬引起的杀菌效率，NETs可以对多种病原微生物都有杀灭和清除的作用，但是人体血液中存在可以降解NETs的脱氧核糖核酸酶1(Dnase1),当此酶缺乏时，大量NETs会聚集，NETs中的多种蛋白酶和抗菌肽可以导致内皮及上皮细胞的损伤，而组蛋白是造成损伤的主要原因，因为组蛋白不仅有抗菌作用，也有很强的毒性。NETs也会与炎性介质呈协同作用，并与血小板之间正反馈激活参与急性肺损伤的发病。慢性阻塞性肺疾病是一种非常典型的慢性炎症反应性疾病，患者的痰液中存在胞外DNA，其结构与NETs-DNA相似[19]，证明NETosis参与COPD的过程，Ting Liu[20]等同样证明了上面的观点。

3.2NETs与自身免疫病

①小血管炎(ANCA-associated vasculitides,AAV)是一种自身免疫疾病，主要累及全身多个系统，ANCA主要作用于髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞表面靶抗原蛋白酶3(PR3)是导致韦格纳肉芽肿及多脉管炎发生的一个原因，而Kessenbrock等[21]则证实了TNF-a(肿瘤坏死因子a)可以被ANCN活化刺激产生NETs，NETs存在特异靶抗原PR3、MPO并呈递给树突状细胞，这是一个恶性循环。②系统性红斑狼疮(SLE)患者的中性粒细胞极易形成NETs，部分患者因为降解NETs的能力不良，机体组织会因为NETs成分持续暴露产生损伤，同时再次作为抗原产生免疫反应。NETs、IFN-a与炎性小体相互发生作用，可以形成病理性的反馈环路，SLE患者中性粒细胞可以产生变异，称为LDGs可以促进大量炎性介质的释放，大量损伤内皮细胞。③类风湿关节炎(RA)是一种以多关节对称受累的慢性炎症性的自身免疫性疾病，主要累积小关节，陈本露等[22]选取88例类风湿关节炎患者作为实验组，20例健康体检者为对照组，检测dsDNA/NETs证明RA患者血清中NETs换辆高于正常人，病人外周血中中性粒细胞PAD4mRNA表达显著增高，且外周血中PBMCs中组蛋白瓜氨酸化显著升高，不排除与类风湿关节炎发病有关，甚至与病情严重程度呈正相关。

3.3NETs与其他相关疾病

最新研究表明NETs对血栓和凝血形成有促进作用，NETs的ROS主要通过诱导内皮细胞损伤来促进血栓的形成[23]。同时又可与血小板相互作用促进血栓的形成及提高血栓的稳定性，并且NETs具有抵抗rt-PA对血栓诱导的溶解作用[24].在静脉血栓中，NETs为静脉血栓形成提供了一个骨架结构很集中的细胞及刺激因素，它可以不受纤维蛋白途径的影响[25]，同时，NETs可以刺激内源性。动脉血栓主要由动脉粥样硬化板块的侵袭或者破裂引起，既往有研究[26]证明：在动脉粥样硬化的病变中存在NETs，同样我们我们也可观察到NETs[27]出现在急性心肌梗死、脑梗死患者的新鲜溶解的血栓标本。有研究证明[28]主要机制是存在于自体DNA和中性粒细胞内部的克里蛋白可以活化血管壁中血浆树突，并且I型的干扰素会同时发生反应。据报道[29,30]，肿瘤细胞增殖、远处转移及血管生成也可能与NETs中的多种组分有关，这为我们治疗肿瘤提供了一个新思路，有待进一步研究。

4 小结与展望

NETs在多种疾病发病、治疗方面逐渐占有重要地位。一方面，NETs可以导致多种自身免疫病的发生，另一方面NETs也具有诊断、预测、靶向治疗、预后等作用。比如cf-DNA/NETs可以作为监测炎性过程的重要标志物，血浆中cf-DNA/NETs浓度水平与急性心肌梗死严重程度相关，急性脑梗死动脉血栓中会存在大量NETs的成分,NETs有可能为急性脑梗死溶栓治疗提供了一个新的靶点。再如，NETs的循环可以被DNase或者PAD4抑制剂阻断，这将成为抗肿瘤的一个新的靶点。但同时，我们需要控制NETs产生与溶解的平衡，不可以在机体中产生过多的NETs。综上，我们应深入研究NETs，避免自身免疫病的发生及一些疾病新的靶点治疗。

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