铕螯合剂对甲胎蛋白单克隆抗体标记的研究

孙延文，谢文兵，刘秀霞，常 宇，潘利华，于 庭*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春130022)

标记免疫分析是将高度灵敏的标记示踪技术与高度特异性的抗原抗体反应相结合的分析技术。其中时间分辨荧光免疫分析结合能量共振转移理论构成了均相时间分辨荧光免疫分析(HTRF)。与异相免疫分析相比，均相免疫分析不需要繁琐的分离步骤，更符合现代自动化快速检测的要求。该技术广泛应用于基础研究、临床诊断、药物筛查等领域[1,2]。

为了建立HTRF，通过一系列反应合成铕螯合剂(Eu3+⊂2,6-{N,N’,N,N’-[二(2,2’-联吡啶-6,6’-二甲基)]二(氨甲基)}-吡啶-二羧酸)，标记甲胎蛋白单克隆抗体(AFP-McAb)，并对标记抗体的标记效果进行研究。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

高效HTRF分析仪(BMG RUBYstar)、MK3型酶标仪(Thermo)、超微量分光光度计(Thermo)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(Thermo)、AFP-McAb M0110(南京京达生物公司)、HRP标记羊抗鼠抗体(Jackson)。

1.2抗体标记过程

1.2.1配制溶液 称取铕螯合剂、EDC和NHS,配制成浓度分别为0.5、25、7.5 mg/ml的水溶液。

1.2.2铕螯合剂的活化 将99 μl EDC溶液加入到99 μl NHS溶液中混匀，再加入到238 μl的铕螯合剂溶液中，间隔混匀数次，室温反应24 h。

1.2.3偶联抗体 加入PH7.4 10 mM PBS，调节PH为7，将400 μg AFP-McAb分三次加入到活化的铕螯合剂中，间隔混匀数次，4℃反应24 h。

1.2.4透析 将标记的AFP-McAb在PH7.4 10 mM PBS中进行透析，每隔4 h换液一次，次日将透析后的标记抗体移取至EP管中，经超微量分光光度计测定抗体浓度并保存。

1.3荧光强度的测定

铕螯合剂溶液浓度调至5×10-4mg/ml，进行2倍系列稀释，标记抗体按照1∶10、100、1 000进行稀释，50 μl/孔，加入到96孔全白酶标板中，设定复孔，在高效HTRF分析仪上测定620 nm处荧光强度。

1.4免疫活性的测定

用PH9.6 50mM碳酸盐缓冲溶液分别配制浓度为1.5、1.0、0.5 μg /ml的AFP溶液，加入到96孔酶标板中，100 μl/孔包被，4℃过夜。次日，用0.01 M PBST溶液，250 μl/孔，冲洗3次，拍干；加入封闭液200 μl/孔，37℃封闭2 h ；弃掉孔内液体，拍干备用。

标记抗体与未标记抗体的起始浓度调整一致，分别1∶1 000稀释，再依次3倍梯度稀释；分别加入到包被板中，100 μl/孔，设定对照，37℃孵育0.5 h；弃掉孔内液体，加0.01 M PBST溶液250 μl/孔，冲洗3次，拍干；加入酶标二抗100 μl /孔，37℃孵育0.5 h；弃掉孔内液体，用0.01M PBST溶液250 μl/孔，冲洗5次，拍干；加显色液100 μl/孔，37℃孵育10 min；加入终止液50 μl/孔；在酶标仪上进行检测，读取OD值。

2 结果

2.1铕螯合剂的特点

铕螯合剂的结构式如图1所示，它是双功能穴状螯合剂。该铕螯合剂含有吡啶-2,2-联吡啶结构，通过共价形式将铕离子包绕在内，当受到激发时，该结构可俘获能量，通过分子结构内能量转移将部分能量转移给铕离子，使其发出相应的荧光。该铕螯合剂的激发光谱是250-340 nm，发射光谱是620±10 nm，斯托克斯位移达290 nm，荧光寿命达900 μs。它带有两个羧基基团，在偶联剂的作用下偶联抗体上的氨基，标记在相应的抗体上。

图1 铕螯合剂结构式

2.2铕螯合剂的荧光强度

铕螯合剂溶液系列稀释测定荧光强度，并对数据进行线性拟合，如表1和图2所示，随着铕螯合剂浓度的减小，荧光强度也随之减小，线性方程为Y=5.05×108X-475(R2=0.999 3)。

表1 铕螯合剂系列稀释溶液的荧光强度

图2 铕螯合剂溶液浓度与其荧光强度的关系

2.3标记抗体的荧光强度

标记前后AFP-McAb的浓度，如表2所示。根据标记抗体的荧光强度计算回收率和标记率，如表3所示。回收率=标记抗体(mg/ml)×标记后体积(ml)÷抗体投入量(mg) 。标记率=标记抗体上铕螯合剂的摩尔浓度÷标记抗体的摩尔浓度。AFP-McAb的回收率为94%，标记率为15。

表2 标记前后抗体的量

表3 标记抗体的荧光强度

2.4标记抗体免疫活性

探究铕螯合剂标记对AFP-McAb免疫活性的影响，首先确定最佳包被浓度。如图3所示，不同浓度的AFP溶液分别进行包被，随着抗体浓度的增加，OD值逐渐增大，当抗体浓度大于6.9×10-6mg/ml时，OD值逐渐达最大值；同浓度抗体反应时，随着包被抗原浓度的增加，OD值也相应增大。结果表明最小包被浓度0.5 μg /ml可满足抗体免疫活性的检测。

图3 甲胎蛋白最佳包被浓度的确定

图4 标记抗体与未标记抗体免疫活性的比较

结合以上数据，调整AFP包被浓度和稀释比例重新测定并作图。如图4所示，随着抗体浓度的减小，OD值逐渐减小；同浓度的标记抗体与未标记抗体相比，OD值未见明显变化。

3 讨论

稀土螯合剂的标记是建立HTRF方法的关键部分。与传统的荧光标记物质相比，稀土螯合剂的激发光谱宽，发射光谱窄而尖锐，斯托克斯位移大，而且其荧光寿命长，是传统荧光的1000多倍，利用时间分辨技术可有效地消除激发光及本底自发荧光的干扰，提高了检测的灵敏度。

稀土螯合剂作为重要的标记示踪物质，广泛应用于HTRF中。在细胞凋亡领域，利用铽螯合剂标记组氨酸抗体作为能量供体，荧光素标记Smac蛋白作为能量受体，研究X连锁凋亡抑制蛋白的作用机制[3]。在疾病感染方面，利用铕螯合剂和Alexa Fluor647荧光染料，结合protein L的特点建立HTRF的方法，用于急性汉坦病毒感染[4]和布氏杆菌感染的血清学检测。还有研究利用铕螯合剂检测丝氨酸/苏氨酸在蛋白质磷酸化过程中的作用机制[5]。

甲胎蛋白是一种分子量约为70 kD的糖蛋白，主要在胎儿的卵黄囊和肝脏细胞内合成。在一些恶性肿瘤患者的血清中，AFP含量升高，尤其在原发性肝癌患者血清中，其含量升高更为显著。目前，AFP已成为早期辅助诊断原发性肝癌的重要血清标志物，对疾病的监测以及治疗具有指导作用。

临床检测AFP的方法有放射免疫分析、酶联免疫分析、胶体金法、化学发光免疫分析等。传统的荧光、放射以及酶联免疫分析并未达到灵敏度高、试剂稳定、线性范围宽等要求，化学发光免疫分析虽具有以上优点，但其发光时间短、受反应环境的影响，而HTRF由于结合了时间分辨和能量共振转移理论，除具有以上优点外，还具有操作简便、可重复检测、不受环境影响等特点。

该铕螯合剂对AFP-McAb标记的过程中，根据铕螯合剂溶液浓度与其荧光强度之间的线性关系(R2=0.9993)，作出标准曲线计算标记抗体中铕螯合剂的摩尔浓度，再依公式计算出标记率。标记率的高低会影响检测的灵敏度。通常抗体的标记率Eu3+/IgG在5-15个较为理想[6]。标记过程中，偶联反应的比例、时间、酸碱度等都可能会影响抗体的标记率。但是，抗体的标记率并不是越高越好，其值越高，荧光强度越高，会造成本底的升高，降低检测的灵敏度，也会影响抗体的免疫活性。低标记率抗体可能更有利于HTRF的建立，这还需进一步的研究。

AFP-McAb是免疫球蛋白，作为有机分子的稀土螯合剂标记在抗体上会改变抗体的结构，造成抗体之间的交联，从而影响抗体的免疫学活性。而该铕螯合剂的分子量为738，其分子量远远小于AFP-McAb的分子量(150 kD)，所以在一定标记率的情况下，该铕螯合剂对抗体的空间结构影响是有限的，其标记反应条件也较为温和，进而对免疫活性影响较小。

因此，通过对标记过程中标记率、荧光强度以及免疫活性的研究，该自合成的铕螯合剂对甲胎蛋白单克隆抗体的标记效果较为理想，可以进一步用于均相时间分辨荧光免疫分析的建立。

[1]Blanc E，Wagner P，Plaisier F，et al.Design and validation of a homogeneous time-resolved fluorescence cell-based assay targeting the ligand-gated ion channel 5-HT3A[J].Analytical Biochemistry，2015，484：105.

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[6]吴英松，李 明，编.时间分辨荧光免疫技术[M].北京：军事医学科学出版社，2008：24-25.