高效液相色谱法同时测定化妆品中香兰素和乙基香兰素的含量

黄 键，张文国，郭桂萍，倪 鹏，施锦辉，王金娟

（南通出入境检验检疫局，南通226000）

香兰素全名3－甲氧基－4－羟基－苯甲醛，又名香草醛，分子式为C3H8O3，是人类合成的第一种香料。乙基香兰素全名3－乙氧基－4－羟基苯甲醛，又名乙基香草醛，分子式为C9H10O3。香兰素和乙基香兰素都具有浓烈的奶香味，是食品加工中经常使用的香味添加剂，常用于糖果、饼干、饮料、糕点、冰淇淋等的制作中以增强它们的香味。

目前香兰素类香精主要由人工合成得到，食用香兰素类香精含量过多的食品可能会导致人体不适甚至损伤肝、肾、脾等脏器。除食品领域外，香兰素类香精也被广泛应用于化妆品的加工中。有数据显示，化妆品中大量使用香兰素类香精可导致人体过敏等反应［1］。目前香兰素类香精的检测主要集中于婴幼儿食品［2－9］、饮料［10－14］等食品 领域，常见 方法有电化 学 法［15－16］、紫 外 分 光 光 度 法［17－19］、气 相 色 谱法［2－3，14］、气 相 色 谱－质 谱 法［6，11］、 液 相 色 谱法［8，10，12－13，20－26］和液相色谱－质谱法［4，7，9，27］等，而化妆品中香兰素类香精的检测还未见报道。本工作建立了测定化妆品中香兰素和乙基香兰素的高效液相色谱法，为化妆品安全质量监控和检测提供了技术支持。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 1200型液相色谱仪，配四元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样系统和二极管阵列检测器；KQ－700VDE型超声波清洗仪；LG 10－2．4A 型高速离心机；IKA S25型涡旋均质器；Milli－Q型去离子水发生器。

香兰素与乙基香兰素标准储备溶液：1．00g·L－1，分别称取香兰素与乙基香兰素标准品（纯度大于99%）各50．0mg于50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至50mL。避光，于4℃冷藏保存，有效期为6个月。

香兰素与乙基香兰素混合标准溶液：200mg·L－1，分别移取1．00g·L－1香兰素和乙基香兰素标准储备溶液适量于50mL棕色容量瓶中，用甲醇（1＋1）溶液稀释至刻度，摇匀。避光，于4℃冷藏保存，有效期为6个月。

甲醇、乙酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，试验用水为去离子水。

1．2 色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（150mm×4．6mm，5μm）；柱温为30℃；进样量为10μL；流动相为甲醇与1．5%（体积分数，下同）乙酸溶液以体积比35∶65组成的混合液；流量为1．0mL·min－1；检测波长为280nm。

1．3 试验方法

1．3．1 膏状样品

称取样品1．0g于15mL具塞刻度离心管中，加入四氢呋喃4mL，涡旋振荡，待样品完全溶解后用甲醇定容至10mL。水浴中超声提取15min，以转速6 000r·min－1离心分离5min，取上层清液过0．22μm滤膜后，按色谱条件进行测定。

1．3．2 乳状、水状及固体样品

称取样品1．0g于15mL具塞刻度离心管中，加入甲醇至近5mL，涡旋振荡1min，用甲醇定容至10mL。水浴中超声提取15min，以转速6 000r·min－1离心分离5min，取上层清液过0．22μm滤膜后，按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

混合标准溶液和空白样品的色谱图见图1。

图1 混合标准溶液和空白样品的色谱图Fig．1 Chromatograms of mixed standard solution and the blank sample

2．2 提取溶剂的选择

膏状样品在甲醇中难以溶解，因此使用适量的四氢呋喃先将其溶解后再使用合适的溶剂进行提取。

常使用的提取溶剂有甲醇和乙腈两种，试验结果表明：使用甲醇或乙腈提取目标物，回收率没有明显差异。由于流动相使用了甲醇，且考虑到成本控制，试验选择提取溶剂为甲醇。

2．3 色谱条件的选择

2．3．1 色谱柱

两种香兰素均含有酚羟基，有一定的极性，必须选择性地使用合适的色谱柱才能实现目标化合物的有效分离与测定。试验考察了ZORBAX SB－C18、ZORBAX Eclipse Plus C18、ZIC－HILIC 和 Acclaim Mixed－Mode WAX－1等4种色谱柱的分离效果。结果表明：虽然两种香兰素均具有一定的极性，但其极性远不及有机酸或有机碱等强极性化合物，因此在ZIC－HILIC和 Acclaim Mixed－Mode WAX－1色谱柱上保留较差；使用ZORBAX SB－C18色谱柱得到的色谱峰有一定的拖尾现象；使用ZORBAX E－clipse Plus C18色谱柱调整合适的流动相比例可得到较好的色谱峰。试验选用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱。

2．3．2 流动相

高效液相色谱法中流动相常用的有机溶剂为甲醇或乙腈。使用溶剂的极性会影响目标物在色谱柱上的保留。香兰素与乙基香兰素在溶液中呈弱酸性，流动相的酸度会影响目标物的电离程度。流动相中加入乙酸后，目标物的解离得到了抑制，目标物与色谱柱填料的相互作用得到了增强，最终目标物的分离效果得到了改善。通过不断优化与调整流动相的比例，试验发现使用甲醇与1．5%乙酸溶液作为流动相时，样品中杂质与目标物以及目标物之间可以得到很好的分离。试验选择流动相为甲醇与1．5%乙酸溶液以体积比35∶65组成的混合液。

2．4 标准曲线及检出限

分别移取200mg·L－1香兰素与乙基香兰素混合标准溶液适量，用甲醇（1＋1）溶液稀释成质量浓度为0．5，2．0，5．0，20，50，100mg·L－1的混合标准溶液系列。按色谱条件对上述混合标准溶液系列进行测定，以香兰素与乙基香兰素的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：香兰素与乙基香兰素的质量浓度均在0．5～100mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程及相关系数见表1。

表1 线性回归方程及相关系数Tab．1 Linear regression equations and correlation coefficients

以3倍信噪比计算方法的检出限，香兰素与乙基香兰素的检出限（3S／N）均为0．2mg·kg－1。

2．5 精密度与回收试验

选取空白化妆品样品进行不同浓度水平的加标回收试验，平行测定6次，结果见表2。

表2 精密度与回收试验结果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：香兰素和乙基香兰素的加标回收率为91．3%～97．0%，相对标准偏差为1．0%～1．7%。

2．6 样品分析

按试验方法对10个化妆品样品进行分析，结果表明：2，4，6 号 样 品 中 分 别 检 出 133．3，1．5，7．2mg·kg－1香兰素，其余样品中均未检出香兰素与乙基香兰素。

本工作采用高效液相色谱法同时测定化妆品中香兰素与乙基香兰素的含量。本方法环境友好、操作简单、成本低廉、灵敏度高、准确性和重复性好、适用性强，可用于化妆品中香兰素类香精的测定。

［1］ BASKETTER D A，WRIGHT Z M，WARBRICK E V，et al．Human potency predictions for aldehydes using the local lymph node assay［J］．Contact Dermatitis，2001，45：89－94．

［2］ 刘玉萍．婴幼儿乳制品中香兰素的检测方法研究［J］．湖南文理学院学报（自然科学版），2011，23（2）：51－54．

［3］ 欧菊芳，顾秀英，鲍忠定，等．气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中香兰素和乙基香兰素［J］．江西科学，2011，29（1）：23－25．

［4］ 罗冠中，刘祥，孟云彩．液相色谱串联四极杆质谱法同时测定婴幼儿配方食品中甲基香兰素和乙基香兰素［J］．分析试验室，2011，30（8）：84－87．

［5］ 陶保华，储小军，赖世云，等．婴幼儿配方粉中香兰素和乙基香兰素的检测方法比较［J］．食品安全质量检测学报，2013，4（2）：421－426．

［6］ 赵建国，姜金斗．气相色谱质谱联用测定婴幼儿奶粉中香兰素和乙基香兰素［J］．生命科学仪器，2013，11（5）：40－44．

［7］ 肖锋，张毅，陈沛金，等．高效液相色谱－串联质谱法同时测定婴幼儿配方食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素［J］．食品安全质量检测学报，2014，5（11）：

3431－3436．

［8］ 黄晓林，宋戈．高效液相色谱法测定婴幼儿食品和乳品中香兰素及衍生物［J］．中国乳品工业，2014，42（4）：57－58．

［9］ 韩超，刘滨，朱振瓯，等．液相色谱－串联质谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中4种香料［J］．分析测试学报，2014，33（2）：208－211．

［10］ 单秀梅，卢忠魁，黄越．反相高效液相色谱法测定啤酒中香兰素［J］．中国卫生工程学，2003，2（2）：109－110．

［11］ 韩双，杨金宝，刘宁．气相色谱－质谱／选择离子法测定牛奶中的香兰素［J］．中国乳品工业，2008，36（8）：53－55．

［12］ 林灵超，吴方圆．高效液相色谱法同时测定牛奶中的香兰素与乙基香兰素［J］．化学分析计量，2013，22（2）：60－62．

［13］ 肖珊珊，孙兴权，李一尘，等．高效液相色谱法测定软饮料中香兰素和乙基香兰素［J］．食品安全质量检测学报，2015，6（1）：152－158．

［14］ 单之初，俞红波，沈翔，等．气相色谱法测定黄酒中香兰素含量［J］．酿酒科技，2015（9）：125－127．

［15］ 倪永年，姜云娜．线性扫描溶出伏安法测定食品中的乙基香兰素［J］．南昌大学学报（理科版），2005，29（3）：269－271．

［16］ NI Y N，ZHANG G W，KOKOT S．Simultaneous spectrophotometric determination of maltol，ethyl maltol，vanillin and ethyl vanillin in foods by multivariate calibration and artificial neural networks［J］．Food Chem，2005，89（3）：465－473．

［17］ LUQUE M，LUQUE－PREZ E，ROSA，et al．Supported liquid membranes for the determination of vanillin in food samples with amperometric detection［J］．Anal Chim，2000，410（1／2）：127－134．

［18］ 张国文，倪永年．偏最小二乘－吸光光度法同时测定食用香料香兰素和乙基香兰素［J］．南昌大学学报（理科版），2003，27（4）：341－344．

［19］ YARDIM Y，GLCAN M，SENTRK Z．Determination of vanillin in commercial food product by adsorptive stripping voltammetry using a boron－doped diamond electrode［J］．Food Chem，2013，141（3）：1821－1827．

［20］ 王建华．高效液相色谱法检测食品中香兰素的方法研究［J］．中国卫生检验杂志，2001，11（2）：164－164．

［21］ 黄越，卢忠魁，卢刚．反相高效液相色谱法测定巧克力中香兰素［J］．中国卫生检验杂志，2002，12（5）：566－566．

［22］ 周庆礼，黄艳凤，韩英素，等．高效液相色谱法测定发酵液中的香兰素［J］．色谱，2004，22（3）：295－295．

［23］ 刘祥萍，黄薇．高效液相色谱法同时测定食品中的甲基香兰素和乙基香兰素［J］．中华预防医学杂志，2006，40（4）：296－297．

［24］ 景丽洁，韩伟，闫光烈．用反相高效液相色谱法测定香兰素含量［J］．食品科学，2006，27（4）：205－207．

［25］ 金海涛，马健瑜，王晓珣，等．高效液相色谱法同时测定香兰素与邻位香兰素［J］．分析测试学报，2011，30（2）：222－224．

［26］ 宁霄，金绍明，曹进，等．高效液相色谱法测定乳制品中香兰素的含量［J］．中国药师，2015，18（2）：312－315．

［27］ 杨华梅，杭莉．超高效液相色谱－串联质谱法同时测定食品中4种常用香精［J］．色谱，2015，33（3）：250－255．