猪血凝性脑脊髓炎病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，阮　震，梅建国，张　颖，杨丽梅，李　峰

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州　256600；2.滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州　256600；3.滨州市滨城区里则街道办事处畜牧兽医工作站　256656）

猪血凝性脑脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis，PHE）是由冠状病毒科冠状病毒属的猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）感染引起的一种仔猪急性、高度接触性传染病。本病主要侵害1～3周龄哺乳仔猪，以仔猪呕吐、衰竭或显著神经症状为主要临床特征，死亡率高达20%～100%[1]。自1958年该病在加拿大安大略省首次暴发以来[2]，已在世界范围内广泛分布，给世界养猪业造成了严重经济损失。本文简要概述了PHEV的病原学特征及检测技术研究进展，以期为防治该病提供参考。

1　病毒的发现

PHEV最早于1958年在加拿大安大略省的猪群中被发现。当时于乳猪中发现2种临床表现不同的疾病，一种以突然发生呕吐、继以消瘦为特征，称为猪呕吐消瘦病；另一种主要表现为脑脊髓炎症状，称为猪脑脊髓炎[2]。1971年证明这2种病症均由同一种冠状病毒PHEV引起。我国最早于1986年报道该病。1993年我国台湾地区发生大规模PHE流行，大型猪场仔猪发病率达30%，病死率几乎达100%，造成了严重经济损失[3]。近年来，PHEV在我国多个猪群中被发现，其危害性呈上升趋势。

2　病毒的分类地位

PHEV属于冠状病毒科冠状病毒亚科乙型冠状病毒属成员[4]。猪是该病毒的唯一自然宿主。冠状病毒科下设冠状病毒亚科与环曲病毒亚科，冠状病毒亚科根据病毒抗原的差异性又分为3个属，依次是甲型冠状病毒属、乙型冠状病毒属和丙型冠状病毒属[5]。2003年暴发流行的SARS冠状病毒，其结构明显不同于上述3种冠状病毒群，被划分为第四类环状病毒群。鸭冠状病毒、马冠状病毒、水貂冠状病毒及果子狸冠状病毒也从属于该类病毒群体[6]。

3　病毒的病原学特征

3.1　形态特征及理化特性

PHEV在形态上为典型的冠状病毒，直径为120～170 nm，呈球形或椭圆形，有囊膜，囊膜上有花瓣样纤突[2]。该病毒最大特性表现在被感染细胞可吸附红细胞，能凝集鸡、小鼠、大鼠、仓鼠和火鸡等动物的红细胞。PHEV在56 ℃、30 min或37 ℃、72 h条件下，可被灭活；在冻干和低温时比较稳定，冰冻状态下可存活1年以上；对如乙醚、氯仿及去氧胆酸钠等脂溶剂敏感，不耐热[7]。

3.2　基因组结构及功能

PHEV为不分节段的单股正链RNA病毒。纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、血凝素-酯酶蛋白（HE）、核衣壳蛋白（N）及小膜蛋白（SM或E）5种蛋白共同构建了病毒粒子的外部框架。这5种蛋白功能各异，共同维持着病毒粒子正常的生物功能。结构蛋白S蛋白，是含有抗原表位最多的结构蛋白，主要参与病毒感染宿主细胞时的特异性结合；E蛋白（或称SM蛋白）能够维持 PHEV囊膜结构；M蛋白是整个病毒粒子中含量最高的结构蛋白；HE蛋白是一类特殊糖蛋白，只存在于部分冠状病毒当中，能使红细胞发生凝集；N蛋白有3个高度保守区域，其中序列“FYYLGTGP”存在于所有冠状病毒当中，使得 N蛋白是所有结构蛋白中同源性最高的蛋白[6]。

3.3　培养特性

PHEV可在原代猪肾细胞、脾细胞、甲状腺细胞和睾丸细胞等细胞中增殖，其特征性细胞病变（CPE）是多核巨细胞的形成。病毒感染具有2～4 h的隐蔽期，于感染后12～16 h产生大量的子代病毒，即可见到多核巨细胞（融合细胞）[8]。

4　病毒的流行病学与致病性

在自然条件下，该病仅感染猪，尤其是哺乳仔猪易感，较大的猪多为隐性感染，且隐性感染率很高。病毒通常存在于病猪的上呼吸道及脑组织中，经口、鼻感染发病。不同毒株感染不同日龄猪只后，临床表现明显不同。在老疫区，母猪初乳中含有该病毒抗体，因而哺乳仔猪一般呈隐性感染，断奶仔猪已能抵抗该病。新疫区以3周龄以内的哺乳仔猪易感，多数是在引进新种猪之后发病。感染仔猪通常具有脑脊髓炎型和呕吐消耗型2种临床表现型[9-10]。前者多为急性暴发，可以在患病早期发现，具有较明显的神经症状，具有脑脊髓炎的典型特征；后者由于表现形式多为呕吐或生长缓慢，所以很容易被诊断为胃肠疾病或营养缺乏，是一种慢性临床表型。出现这2种截然不同临床症状的原因，与病毒本身毒力，以及易感动物自身年龄、抵抗能力和个体差异有关[11]。隐性感染猪虽不发病，但会向周围环境散毒，而且病毒在宿主体内长时间复制，极有可能发生基因变异，使病毒毒力增强。隐性感染猪群亦会相继消瘦，发育迟缓，严重影响经济效益。

5　病毒的检测技术研究进展

5.1　病毒分离与鉴定

PHEV能够在PK15、N2a和SK等多种细胞中增殖，从而使宿主细胞发生感染[12]。无菌采集病猪的脑、肺或呼吸道分泌物等主要发病组织，经处理后接种于PK-15细胞或甲状腺单层细胞进行培养，如果有PHEV存在，可在接种后24～48 h出现融合细胞。用血凝试验（HA）对样品进行检测，对阳性样品盲传3代后收取病毒液，反复冻融后离心，取沉淀物，采用磷钨酸进行负染；将负染后的样品置于透射电镜下观察，如有典型的冠状病毒粒子出现，则可确诊为PHEV感染。病毒分离鉴定准确可靠，但对无菌环境要求严格，还进行活病毒培养，费时费力，操作复杂。

5.2　血清学方法

5.2.1血凝/血凝抑制试验（HA/HI） PHEV表面的HE蛋白能够诱导抗体并中和病毒感染，同时可以凝集小鼠和鸡的红细胞。针对这一特点，可以应用HA/HI试验进行检测。刘立卓等[13]应用HA/HI试验对从山东省部分地区采集的178份猪血清样品进行了PHEV抗体检测，发现阳性率高达61.24%（109/178），表明该地区PHEV感染较为普遍。由于仔猪可以通过初乳获得PHEV抗体，因此血清学调查可能存在一定的假阳性，并不能真实反映PHEV感染情况。另外，HI试验还有主观性强、对判定结果的解释难以标准化，以及不适合大批量检测等缺点。

5.2.2中和试验（NT） 中和试验是检测血清中和抗体最常用的方法。Sasaki等[14]在FS-L3细胞上建立了检测PHEV的中和试验。另外，其他易感细胞，如成年猪的甲状腺细胞、睾丸细胞、PK-15细胞和SK细胞等细胞，均可用于PHEV中和试验。中和试验灵敏可靠，特异性高，但费时费力，操作复杂，操作人员需具备一定的专业水平，仅适合在实验室操作，不适用于大规模临床血清学监测。

5.2.3酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、试验结果稳定和极易于自动化操作等优点，已被广泛应用于PHEV血清抗原/抗体的检测。陈克研[15]制备PHEV N蛋白单克隆及多克隆抗体，成功构建并组装了双抗夹心ELISA抗原诊断试剂盒。应用该试剂盒与实验室建立的RT-PCR检测方法，分别对人工感染小鼠和对从吉林省采集的200份疑似病猪样品进行检测，发现2种方法阳性检出符合率都在90%以上。赵传博等[16]应用制备的PHEV单克隆抗体作为检测抗体，猪多抗作为捕获抗体，建立了PHEV抗原捕获ELISA方法，其最低检测下线为3.75 mg/L。刘立卓等[13]以纯化的PHEV全病毒作为包被抗原，建立了PHEV抗体间接ELISA方法，应用该法对从山东省猪血清中随机抽取的44份样品进行检测，发现PHEV抗体阳性率为72.73%（32/44），而HI抗体阳性率为56.82%（25/44），2种检测方法的阳性符合率为92%。单长见等[17]以可溶性表达的PHEV重组N蛋白作为包被抗原，建立了PHEV血清抗体间接ELISA方法，用该法对从天津市采集的200份猪血清样品进行检测，发现阳性检出率为83.50%，与前期工作中建立的全病毒作为包被抗原的间接ELISA方法检测结果符合率为90.91%。该方法为临床检测PHEV感染及流行病学调查奠定了基础。

5.2.4间接免疫荧光（IFA） Andrie等[18]最先将PHEV接种于仔猪，在免疫荧光下发现PHEV主要的复制部位是鼻黏膜、扁桃体、肺和小肠上皮细胞，得到了PHEV抗原在细胞上的初步定位。IFA技术具有很多优点，不需专业人员操作，简便易行，消耗时间较短，适合在养殖场推广和应用。但由于该方法必须要通过荧光显微镜进行观察，只能够做出定性结果，而不能准确定量，所以也在存在一定弊端。

5.2.5胶体金免疫层析技术（GICA） 陈克研[15]将单克隆抗体技术与GICA结合，制备了PHEV胶体金免疫层析试纸条（ICS）。试验证明，该试纸条与ELISA和HI的相关性分别为96.90%和96.69%。应用ICS对吉林省和辽宁省部分地区进行血清抗体调查，发现672份血清样本中，有334份呈阳性，总阳性率为49.70%，表明被检测地区猪群中普遍存在PHEV感染。试纸条具有使用便捷、灵敏度高、特异性强且结果容易判断等优点。

5.2.6免疫组织化学技术（IHCT） IHCT具有特异好、敏感性高和精准度高等特点，是实验室内进行分子病理学相关研究的技术方法。Quiroga等[21]应用此技术，对2006年阿根廷的PHEV感染病死猪进行了形态学和抗原定位。IHCT同IFA一样，能够高特异性地定位抗原，并且在疾病诊断中获得针对该病原的典型性特征，使其在免疫病理学诊断中得到广泛应用。然而，该技术对试验器材要求很高，对于基层养殖业来说，并不是一种实用的诊断技术。

5.3　分子生物学方法

5.3.1RT-PCR Sekiguchi等[22]根据PHEV的S蛋白设计引物，建立了巢式RT-PCR方法，用于检测PHEV。常灵竹等[23]根据PHEV的HE基因和S基因等设计出特异性引物，建立了PHEVRT-PCR检测方法，最低可检测到10 TCID50/100 μL的病毒，具有较好的特异性和敏感性。用此RT- PCR方法对感染PHEV的小鼠和猪进行检测，能从发病动物的多种组织中检测到病原，其中脑组织的检出率最高，提示临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本。

5.3.2荧光定量RT-PCR 臧德跃等[24]根据PHEVS蛋白基因的保守序列设计特异性引物，建立了PHEV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法，应用该方法对采集的20份疑似PHEV感染病料进行检测，发现16份为阳性，而用常规RTPCR检测同样的样品，仅8份为阳性，表明其建立的方法具有快速、特异、敏感和重复性好等优点，可用于临床PHEV检测及定量分析。荧光定量RTPCR方法不仅为PHE早期快速诊断提供了良好的技术手段，也为从分子水平上深入了解PHEV致病机制及有效防治PHE奠定了基础。

5.3.3环介导等温扩增技术（LAMP） 丁宁[19]根据 PHEV较为保守的M基因序列，设计合成了2对LAMP引物，通过优化反应条件，建立了用于PHEV的LAMP方法，应用该方法对从吉林省某猪场采集的15份疑似PHEV感染病例样本进行初步检测，同时用实验室已经建立的荧光定量PCR检测方法作为对照。结果显示，LAMP方法和荧光定量 PCR方法检测的阳性率均为47%（7/15），符合率为100%。尹洋等[20]也研制出一种PHEV的LAMP检方法，并对该病毒进行了检测。结果显示其敏感性要比传统的PCR技术高许多，且用时短。

6　小结

虽然近年来PHEV引发疾病的大规模暴发流行较少，但是根据贺文琦等[25]的血清学调查结果可以推测，该病原在我国部分地区的饲养猪群中十分普遍。许多基层兽医工作者还没有意识到该病的严重性，所以即使临床上发生该病，也可能被忽略或误诊。如果在大型猪场发生该病，危害将是十分严重的。仔猪一旦发病，极少康复。母猪发病后2～3周产出的仔猪一般可通过母源抗体获得保护[26]。该病尚无有效的治疗药物和疫苗，主要依靠加强综合性防治和注重口岸检疫，防止引入病猪。PHEV病原学、血清学和分子生物学检测方法各有优缺点和实用性，需要根据不同的场合和条件等选择合适的方法。虽然上述检测方法为PHEV检测提供了有效的技术手段，但是随着人们对PHEV研究的深入，相信现有的检测方法将不断得到改进，也可能研制出新的检测方法，使PHEV检测更简便、快速和准确。

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