甘薯杂交不亲和性研究进展

杨义伶，张雄坚，姚祝芳，罗忠霞，邹宏达，王章英，黄立飞，房伯平

（广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室，广东 广州 510640）

甘薯〔Ipomoea batatas（L.）Lam.〕为旋花科（Convolvulaceae）甘薯属（Ipomoea）甘薯组（Section batatas）植物［1-2］。因其块根中具有高含量的淀粉，甘薯成为继水稻、小麦、玉米、马铃薯、大麦、木薯之后的世界第七大粮食作物，并与木薯和马铃薯并称为世界三大薯类作物［3-4］。除了高含量的淀粉外，甘薯因富含膳食纤维、类胡萝卜素、花青苷、类黄酮等营养物质，近年来被称为抗癌食物［5-6］。

与多数开花植物一样，杂交育种是甘薯育种的主要途径。但在甘薯杂交育种中也存在较高程度的杂交不亲和性，包括种内杂交不亲和性和种间杂交不亲和性，尤其是种内品种间杂交不亲和性对甘薯育种亲本的选择及种质资源的利用造成了严重的限制，特别是某些具有优异性状的亲本，难以在育种中得以利用，造成遗传基因交流受限，对甘薯育种形成了严重的障碍。因此，对甘薯杂交不亲和性相关机理及克服方法的研究将对甘薯育种工作的推动及种质资源的充分利用具有重要意义。本文主要从甘薯不孕群的划分、甘薯杂交不亲和性生理及分子机制的研究、甘薯不亲和克服试剂的筛选及体细胞杂交对甘薯种内及种间杂交不亲和性的克服等方面对近年来甘薯种内及种间杂交不亲和性研究进行论述，以期为甘薯杂交不亲和性的进一步研究提供基础。

1 甘薯种内杂交不亲和性研究

1.1 甘薯不孕群的划分

因为甘薯种内杂交不亲和性对甘薯育种及种质资源利用的限制，国内外学者相继对其展开研究。Terao于1934年首次提出了甘薯不孕群的概念，根据实验，将51个甘薯品种划分为3个群别，分别为A、B、C群，其中同群品种间杂交不亲和，而异群品种间杂交亲和性强［7］。自此，甘薯品种不孕群的划分工作得以广泛开展，Shigemura在1943年通过对甘薯品种群别的测定，发现了不孕群D群，Schreven在1954年又增加了E、F群［8］。1964年Fujise对254甘薯品种进行不孕群测定时，将其划分为A-H 8个不孕群，其中A、B、C群为日本品种，D群为巴西、台湾、菲律宾品种，E群为美国和墨西哥品种，F群为巴西品种，G、H群为墨西哥品种［9］。随着甘薯不孕群测定品种的增多，新的不孕群也相继出现，至1984年，甘薯品种内已被测出A-O等15个杂交不亲和群及一个X 万能群［10］。

我国为甘薯主要生产国，具有较为丰富的种质资源，对国内甘薯品种进行不孕群的测定将为我国甘薯育种亲本的选择提供依据。针对我国甘薯品种，国内学者沈稼青［11］最早对主要地方品种和育成品种进行了不孕群的测定，并将其划分为7个群别，分别为A、B、C、D群、美国红群、铁线藤群、Al-2群，其中美国红群等因国内未引进16个群的测群代表品种，故以首先测出新群品种名称命名新群。其后，杨中萃等［12］对国内204个甘薯品种（系）进行不孕群测定，并将其划分为A、B、C、D、E群、黎妇群、宝石群、Y8群、八群外群。1992年沈稼青等［13］又利用广东农科院国家甘薯种质资源圃（广州）丰富的甘薯种质资源，对其中的313个品种进行测定，通过测定表明B群品种数目最多，其次分别为A群、D群、C群、A1-2群、美国红群、铁线滕群，与此同时还测出了6个七群外品种和17个半亲和群品种。

甘薯不孕群的划分为甘薯有性杂交亲本的选择提供了依据，提高了甘薯育种效率。我国甘薯品种多数集中在A、B、C群中，尤以B群最多，达50%左右，因此不孕群的划分将避免同群品种杂交，为甘薯杂交亲本组合的筛选提供依据。此外，从国内育成品种亲缘关系看，多数品种具有C群品种胜利百号和B群品种南瑞苕的血统，遗传背景较为单一，近交系数较高，后代杂种优势逐渐弱化，难以体现［14］。因此，选择A、B、C群之外的品种，尤其是地域差异较大，亲缘关系较远的不孕群品种作为杂交育种亲本，将扩大基因类型，丰富遗传基础，提高杂种优势，加速甘薯优良品种的选育。不仅如此，相关学者表明，不孕群的地理分布及不同地区不孕群的数量可以为甘薯的起源及传播研究提供科学依据，且不孕群的划分可作为整理甘薯品种资源的辅助手段，帮助鉴定同种异名及同名异种甘薯资源［13］。

1.2 甘薯种内杂交不亲和性生理机制的研究

植物种内不亲和性主要表现为花粉在柱头不萌发或花粉管在花柱中不伸长现象［15］。有关甘薯种内杂交不亲和性生理机制，从花粉在柱头上萌发、花粉管和柱头的关系研究，多数结果表明主要是柱头抑制花粉萌发作用的结果，早期也将花粉与柱头的识别反应用作甘薯不孕群划分的依据［16］。相关研究表明，胼胝质为柱头对花粉萌发抑制的关键因子，当花粉与柱头接触，来源于绒毡层的花粉外壁蛋白与柱头乳突细胞质膜蛋白识别互作，若亲和，柱头分泌囊泡，提供花粉萌发所需的水合物质；若不亲和，乳突细胞在质膜和果胶纤维层之间积累胼胝质，扰乱花粉的水合作用，进而抑制花粉的萌发［17-18］。

陆漱韵等［19］对甘薯种内杂交不亲和特性进行研究，表明不亲和性主要表现在花粉不能在柱头上萌发，且柱头上的乳突细胞胼胝质反应明显。王克通等［10］对甘薯种内杂交不亲和组合中花粉和雌蕊的关系研究表明，柱头上花粉的粘附量与品种间杂交亲和性呈正相关，而柱头乳突细胞胼胝质反应在某些组合中同花粉与柱头的不亲和程度一致，但在其他组合中却未得以体现。因此，胼胝质拒绝反应不能作为甘薯花粉与柱头亲和性定性与定量的一般性指标。但两者均在研究中发现甘薯种内杂交不亲和性也存在部分组合表现为花粉萌发后的不亲和障碍，这表明甘薯种内杂交不亲和性不只是花粉与柱头的一步性识别反应，也存在于花粉与雌蕊作用的各个阶段。

1.3 甘薯种内杂交不亲和性遗传机制研究

针对植物种内不亲和反应遗传机制的研究，目前主要集中在十字花科、茄科等植物的自交不亲和反应中，主要有两种机制，分别为孢子体自交不亲和以及配子体自交不亲和机制［20-21］。其中孢子体自交不亲和表现为孢子体绒毡层等细胞与柱头乳突细胞质膜蛋白相互识别作用［22］，而配子体自交不亲和表现为配子体花粉细胞与雌蕊蛋白的相互识别作用［23］。与自交不亲和性类似，甘薯种内品种间杂交不亲和性为同型亲本杂交授粉的结果。根据花粉在花柱中的萌发状况及生理表现，甘薯种内杂交不亲和性被认定为孢子体不亲和机制作用的结果［24］。

相关研究已经表明孢子体和配子体不亲和性均由“S”位点复等位基因控制［25］。基于这一理论基础，不同学者对甘薯种内杂交不亲和性遗传作用机理也提出了不同的解释。最早美国学者Hemandez和台湾学者Wang提出甘薯种内杂交不亲和性受单位点“S”复等位基因控制，即每个不孕群受一对等位基因控制，S1、S2、S3、S4、S5，各代表其相应的不孕群［9］。之后Van Schreven在两个亲本的杂交后代中发现4个不孕群，其中2个与亲本同群，另2个分别与其中一个亲本杂交亲和，而与另一亲本不亲和，在此基础上他提出两个位点的孢子体模型，且等位基因间有显隐性关系［16］。与Van Schreven不同，Fujise在进行不同群别品种自交及杂交的试验中发现A群自交得到A与B群，B自交得到B与C群，而C自交只产生C群；A和B、A和C正反交后代能产生A、B、C群，而B和C正反交只产生B和C群，基于上述结果他提出3个基因位点的模型T、S、Z，其中T和S对Z有上位效应［8］。但上述的模型都只是假设，并没有直接的证据。

1.4 甘薯二倍体野生种种内杂交不亲和性分子遗传机制的研究

1.4.1 甘薯二倍体野生种种内杂交不亲和性遗传模式的研究 甘薯为六倍体植株，遗传背景较为复杂，相比二倍体植株甘薯的多倍性提高了甘薯种内杂交不亲和性研究的复杂程度。因此，以二倍体野生种为先导材料进行种内不亲和性研究将为甘薯种内杂交不亲和性研究提供重要的理论基础。Martin［26］于1968年首先对二倍体野生种Ipomoea seliferaPoir 进行分析，通过对5个不同区域的I.selifera群体进行不亲和性测定，将其划分为10个不亲和群，对其中3个最大的不亲和群A、B、C进行杂交后代群体分析，表明I.selifera种内不亲和性受单位点、多等位基因的孢子体不亲和性机制调控，3个等位基因R1、R2、R3，表现为R1、R2在柱头及花柱上对R3呈显性，但两者本身独立作用。与甘薯比较，I.selifera不亲和群杂交后代分离模式与Van Schreven发现的甘薯不孕群之间杂交后代分离模式完全吻合，但等位基因的显隐性等级并没有解释Van Schreven现象。因为甘薯的多倍性，Martin［26］在I.selifera的基础上提出了双位点孢子体模型，其中位点间的上位效应及等位基因间的显隐性关系很好的解释了Fujise和Van Schreven假说。Kowyama等［27］于1980年选择了与甘薯亲缘关系更近的甘薯组二倍体野生种Ipomoea leucanthaJacq进行不亲和性的遗传分析，通过正反交、回交、测交后代群体遗传分析表明，I.leucantha种内不亲和性也受单位点、复等位基因的孢子体不亲和机制调控，且获得S1S2、S1S3、S2S2、S2S3和 S3S3基因型植株。为了进一步测定S位点的基因型，Kowyama等［28］对二倍体野生种Ipomoea trif i da的224棵植株进行遗传重组分析，49个S位点基因型被测出，其中的28个在花粉和柱头上表现出六个水平的线性显隐性关系，相比花粉，S位点等位基因的共显性在柱头的频率更高。

1.4.2SRK/SLG同源基因在甘薯二倍体野生种中的克隆与分析 孢子体不亲和分子机制在十字花科植物中已被广泛的研究，其主要的作用机理为花粉外壁蛋白SCR（S-locus cysteine-rich protein）/ SP11（S-locus protein 11)与花柱乳突细胞质膜蛋白SRK（S-locus receptor kinase）的特异识别互作，进而促使柱头对同一品种或同一基因型品种花粉产生不亲和作用［29］。与十字花科植物一样，甘薯及其野生种同为孢子体不亲和机制调控，为了探究SRK/SLG（S-locus glycoprotein）在甘薯种内杂交不亲和调控机制中的作用，Kowyama等［30］对I.trif i da花柱、花药等组织中同源基因进行克隆，通过PCR扩增获得4个IPG1-IPG4基因片段，与十字花科植物的SRKs/SLGs蛋白序列具有40%～46%的相似性。其中IPG1在成熟的柱头和花药组织上均有表达，并在开花前1 d表达量最高，但在开花前2～3 d只在柱头上表达。以IPG1为探针，对其全长cDNA进行杂交筛选，得到对应于十字花科植物SRK cDNA全长的转录本，命名为IRK1基因。蛋白结构分析表明，IRK1与十字花科植物的SRK蛋白类似，包含一个胞外受体结构域及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶序列。但基因表达模式及RFLP结果显示IRK1与S位点不连锁，且表达模式也与十字花科植物有所差异，表明甘薯可能具有不同于十字花科植物的孢子体不亲和调控机制［31］。

1.4.3 甘薯二倍体野生种S位点区域及种内不亲和性调控基因的筛选与鉴定 SLG和S-Rnases最初是通过双向电泳（2D-PAGE）在芸薹属和烟草属植物中鉴定所得［32-33］，为了对I.trif i daS位点蛋白进行筛选，2D-PAGE也被用于I.trif i da柱头蛋白的分离鉴定，通过分离鉴定筛选到4个SSP（Slocus-linked stigma protein）基因，其氨基酸序列相似性高达95%～98%，且主要在成熟的乳突细胞表达，在开花时表达量最高，同源比对表明SSP为SCAD（short-chain alcohol dehydrogenase）同源基因。利用RFLP进行遗传连锁分析，将SSP定位于距离S位点1.2 cM位置，表明SSP蛋白并未参与I.trif i da种内不亲和反应，尽管如此，以SSP为分子标记进行S位点紧密连锁基因的鉴定是有效的［34］。在十字花科、茄科等植物中，突变体的出现已为自交不亲和机制研究的提供了重要材料。通过调查筛选，自交亲和突变体株系MX1在I.trif i da中被发现，遗传分析显示突变性状为S位点基因突变产生，将其突变基因命名为Sc，以SSP基因为探针对其杂交后代群体进行RFLP遗传连锁分析验证了Sc为S位点等位基因，显隐性关系测定表明S22＞S1＞Sc＞S3［35］。随着分子标记的发展，AFLP和AMP技术被发展用于I.trif i daS位点附近连锁图谱的构建，经测定8个与S单倍型共分离的DNA标记被定位于S位点附近，其中AAM-68与S位点连锁最为紧密，这些标记的选定将为S位点基因的克隆提供基础［36］。

为了对其进行进一步研究，Tomita等［37］利用图位克隆对I.trif i da基因组S位点区域进行鉴定，通过构建BAC文库和利用前期筛选的标记，结合RFLP后代重组分析，将S位点定位于0.57cM区域，物理距离为300kb左右。为了进一步确定S位点区域物理大小，Rahman等［38］利用遗传重组和基因组测序对其重组断点进行测定，将S位点遗传距离缩小至0.23 cM，对应最大物理距离为212 kb，且通过比较不同单倍型S1和S10基因组序列，发现S1和S10 S位点区域中的 50.7 kb和34.5 kb为S单倍型特异多态性区段（SDR），而其两端区域具有高度的序列相似性，基于SDR的大小，IpomoeaS位点物理大小被预测为34～50 kb。对SDR区域进行RNA印记分析，筛选得到6个基因在雌蕊或花药中特异表达，RT-PCR验证表明SE1、SE2、SEA在柱头上特异表达，AB2在花药中特异表达，且均在开花前表达量最高，原位杂交显示AB2在花药中绒毡层细胞中表达，且不同单倍型序列分析表明这4个基因具有高度的序列多态性，因此推测其为Ipomoea孢子体不亲和系统中雌蕊和花粉的候选基因［39］。上述研究结果为甘薯种内杂交不亲和性分子机制研究提供了基础，但有关甘薯种内杂交不亲和性调控机理的研究目前还处于空白状态。

1.5 甘薯种内杂交不亲和性的克服

甘薯种内杂交不亲和性对甘薯育种亲本的选择及种质资源的利用造成了严重的限制，对甘薯育种形成了严重的障碍，因此对甘薯种内杂交不亲和性克服方法的研究也一直受到相关学者的广泛关注。在十字花科、茄科等植物中，相关研究表明对柱头热处理、CO2处理及蕾期授粉等对其不亲和性具有一定克服作用［35］。为了克服甘薯种内杂交不亲和特性，相关方法也被用于甘薯柱头处理，但均未获得效果。国内学者陆漱韵等［40］对切割柱头和花柱处理、延迟授粉、蒙导授粉、有机溶剂处理柱头、温度处理及植物生长调节剂处理等方法进行比较筛选，结果表明NAA、6-BA、2,4-D等生长调节剂可延长花器寿命，提高结实率，对甘薯种内杂交不亲和性具有一定克服作用，但主要针对具有花粉萌发后不亲和障碍的组合有效，而对典型的花粉萌发障碍不亲和组合效率较低。之后，张立明等［41］用6-BA、2,4-D对A和D群不亲和杂交组合进行处理，结果表明一定浓度的6-BA、2,4-D的处理可使 A 群的千系682-11×济南红正反交结实率分别提高到15.0%和13.1%，D群的红红 l 号×济薯10号的结实率分别提高10.4%和10.8%，但对两群内其他组合的结实率影响较小。相比植物生长调节剂，张雄坚等［42］经过多年的筛选得到了一种诱导配方液，通过诱导配方液的处理可以促进具有花粉萌发障碍不亲和组合花粉的萌发并获得种子，为甘薯种内杂交不亲和反应的克服提供了一种相对行之有效的方法。

随着现代分子生物学的迅速发展，基因工程等现代分子育种技术成为作物遗传育种的重要途径，体细胞杂交成为克服杂交不亲和性的重要技术手段。1993年Murata等［43］用电融合方法获得了甘薯品种间体细胞杂交再生植株，但未对其杂种性进行鉴定。为了克服甘薯的种内杂交不亲和性，王晶珊等［44］利用PEG融合法对B群内杂交不亲和品种koganesengan和bitambi进行原生质体融合，通过原生质体再生培养获得4株体细胞杂种再生植株，其中两株染色体数为亲本染色体数之和（2n=12X=180），另外两株分别为41～103和35～100，RAPD分析显示，4棵植株分别具有双亲特异或双亲不具有的新扩增条带。这些体细胞杂种植株的获得为甘薯种内杂交不亲和性的克服及育种新方法的开拓奠定了基础。但因甘薯体细胞杂种存在生长势弱、分枝少、结薯少或不结薯、花朵小、育性低等问题，目前其在甘薯育种及生产中的应用仍具有一定局限性。

2 甘薯种间杂交不亲和性研究

2.1 甘薯近缘野生种在甘薯育种中的应用

甘薯与其近缘野生种统称为甘薯组，根据与甘薯杂交的亲和性，甘薯及其近缘野生种被划分为A群和B群，A群包括I.triloba（2x），I.lacunosa（2x），I.gracilis（4x） 和I.tiliacea（4x）；B群包括I.batatas（6x）（甘薯栽培种），I.littoralis（4x），I.leucantha（2x） 和I.trif i da（6x）及其系列2x，3x，4x种。其中A群和B群同一群内各种之间表现为杂交亲和，但群间表现为杂交不亲和，且B群内各种均表现为自交不亲和［45-46］。甘薯近缘野生种为甘薯育种的重要种质资源，存在很多甘薯栽培种不具有的优良基因，对其抗病虫、抗逆、高淀粉等优良基因的利用将为甘薯品种的改良拓宽基因资源。日本学者早期利用六倍体野生种I.trif i da（6x）与甘薯杂交，从其后代筛选出具有1/8野生种血统的抗线虫病及高淀粉品种“南丰”，打破了常规甘薯品种间杂交育种的局限性，为甘薯育种开拓了一条新的途径［47］。在国内，江苏农科院利用六倍体野生种I.trif i da（6x）也育成了具有1/8野生种血统的苏渝303和渝苏297，其中苏渝303为优良的淀粉加工兼饲料用甘薯品种，渝苏297为优良的早熟高产型甘薯品种，且两者均具有良好抗病性［48］。

2.2 甘薯种间杂交不亲和性生理机制的研究

尽管如此，在育种实践中，甘薯近缘野生种的应用目前仅局限在I.trif i da（6x），对其他近缘野生种的利用较少，尤其是A群野生种，因其与甘薯杂交不亲和，严重限制了A群种在甘薯育种中的应用。因此，甘薯及其近缘野生种种间杂交不亲和性的克服将为野生种基因资源在甘薯育种中的引入与利用提供重要基础。陆漱韵等［19］对甘薯与A群野生种种间杂交不亲和特性研究表明，其不亲和特性表现为三种类型：花粉不萌发或产生极短花粉管，且柱头乳突细胞产生胼胝质反应；花粉萌发延迟，花粉管生长缓慢、停滞；花粉正常萌发，花粉管生长受阻。但根据花粉在柱头上的表现表明主要为花粉萌发后的抑制，其中生理不协调为主导因子，且在不同的组合中几乎未观察到正常的受精作用。

2.3 甘薯种间杂交不亲和性的克服

基于植物生长调节剂在甘薯种内杂交不亲和性的克服作用，王家旭等［49-50］利用2,4-D、BA等生长调节剂对A群野生种I.triloba和B群甘薯栽培种徐薯18等杂交组合进行处理，结果表明植物生长调节剂可延长花器寿命，克服甘薯种间杂交不亲和性，但因胚、胚乳和子房的不协调性，所得种子不萌发或萌发后死亡，而对其进行胚培养可克服胚胎的发育不良，获得杂种植株，最终实现甘薯组中A群与B群种间的基因交流。翟红等［51］利用2,4-D结合胚培养获得了徐薯18与I.lacunosa的杂种后代，其后代表现为雌雄蕊发育正常，且具有明显的结薯性，这也是首次发现的具有结薯性的A群和B群种间杂种后代，为A群基因资源在甘薯育种中的应用奠定了基础。

此外，体细胞杂交为克服物种间远缘杂交不亲和性的有效途径，梁晓光［52］利用PEG融合法对甘薯栽培品种栗子香、农大红与A群野生种I.triloba进行原生质体融合，分别获得24和132株体细胞杂种再生植株，田间表现大部分杂种植株生活力和生长势均较弱，且地下部均不膨大。Zhang等［53］对甘薯品红栗子香、徐薯18、Tamayutaka与A群野生种I.lacunosa进行原生质体融合，共获得108株体细胞杂种再生植株，且三个组合的体细胞杂种均表现为可育。郭建明［54］分别对甘薯品种高系14与I.triloba，徐薯18与I.lacunosa进行原生质体融合，获得92和74株体细胞杂种再生植株，并分别首次从其体细胞杂种植株中筛选出具有良好膨大块根的株系。这些体细胞杂种的获得丰富了甘薯育种材料，为甘薯育种提供了重要的基因资源。

3 展望

甘薯具有丰富的种质资源，我国国家甘薯种质资源圃内目前保存有2 000多份甘薯资源，国际马铃薯中心保存有7 000多份［55］，这些资源的存在为甘薯育种提供了丰富的亲本材料，但因甘薯存在的种内和种间杂交不亲和性，其对甘薯种质资源的利用及甘薯的育种进程造成了严重的限制。针对甘薯杂交不亲和性，国内外学者已经开展了大量研究，包括不孕群的划分、不亲和性生理及分子遗传机制的研究、不亲和性克服试剂的筛选及体细胞杂交对甘薯不亲和性的克服等。但相关研究还处于初级阶段，尤其是分子机制的研究，因甘薯为六倍体植株且具有复杂的遗传背景，加之早期研究材料及方法的限制，目前甘薯杂交不亲和性分子机理的研究还处于空白状态。

但随着现代科技的发展，尤其是现在分子生物学的迅速发展，相关研究手段已经发生了根本的变化，为甘薯杂交不亲和性研究提供了便利与机遇。首先，随着基因组时代的到来，水稻、柑橘、木薯等重要粮食和经济作物已经完成基因组测序，甘薯二倍体野生种I.trif i da和甘薯栽培种泰中6号在近年来也相继完成了基因组测序［56-57］，尤其是甘薯栽培种在2017年的测序完成为甘薯杂交不亲和性的研究提供了重要信息平台。其次，转录组、蛋白组、代谢组等组学的发展，为甘薯杂交不亲和性关键基因及其分子调控机制的研究提供了强有力的大数据平台。再次，随着近年来分子标记、转基因等技术的发展，尤其是甘薯转基因技术体系的建立［58］，为甘薯杂交不亲和功能基因的筛选和鉴定提供了技术平台。第四，种内不亲和机制除了在十字花科、茄科、罂粟科等典型的植物中研究，近年也相继在芸香科［59］、蔷薇科［60］、菊科［61］等植物中得以拓展，且其机制研究从原有S位点单基因研究转向不亲和分子机制通路研究，这些研究结果将为甘薯杂交不亲和分子机制的研究提供重要的参考依据。此外，随着甘薯营养价值和经济价值的逐渐体现，甘薯产业体系逐渐完善，加入的科技人才也逐年增多，且国家针对甘薯产业建立了国家甘薯产业技术体系，在人员、政策、经费方面加以投入和倾斜，这些为包括甘薯杂交不亲和性在内的研究提供了强有力的支撑。