茯苓菌丝蛋白双向电泳体系的建立及质谱鉴定

李洪波， 向小亮， 罗海燕， 胡 兴*

（1．怀化学院 生命科学系，湖南 怀化 418008；2．中国科学院广州生物医药与健康研究院，广东 广州 510530）

茯苓（Poria cocos（Schw.）Worf）为担子菌纲多孔菌科真菌，药用部位为菌核。茯苓为常用中药材，亦可作食用。茯苓用作食材可以煮粥、熬汤、泡茶、加工成各种糕点和面条等。茯苓的药理作用主要表现在利尿、镇静、抗肿瘤、增强免疫等方面，其主要活性成分为茯苓多糖和三萜系化合物[1-4]。茯苓蛋白质约占茯苓菌丝体干质量的1.5%，目前对茯苓菌丝体蛋白的研究报道还很少。近年来，与免疫调节功能相关的茯苓蛋白陆续被发现[5-8]。最近，研究者从茯苓中发现一种与樟芝免疫调节蛋白1（Aca1）同源性很高的蛋白质即茯苓免疫调节蛋白-1，通过构建茯苓菌丝体的EST库还发现了另一种可能具有免疫调节蛋白WCPCP等[9-10]。茯苓真菌寄生于松树根部，通过分解松树根或树干中的纤维素和半纤维素进行自身营养供给，形成菌核，因此茯苓在生长过程中会分泌具有重要潜在应用价值的酶类，如纤维素酶、半纤维素素及木质素酶等。茯苓菌丝体中有哪些蛋白质，具有重要功能的蛋白质还有待发现和开发。蛋白质双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）是多年来蛋白质组学研究的主要方法，在食用菌研究中也得到较多应用[10-13]。液体发酵培养可以连续大规模地生产茯苓菌丝体，缩短生产周期并能节省大量松木，减少对环境的破坏，而且液体发酵培养可以对培养基成分和发酵条件进行精确控制[14]。因此，应用2-DE技术研究摇瓶培养条件下的茯苓菌丝蛋白质组学，为进一步深入研究茯苓菌丝中的重要功能蛋白质和差异基因表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 “湘靖28号”茯苓种由作者所在实验室保存。

1.1.2 试剂 IPG Strips、40%Acr/Bis（37.5∶1）溶液、Bio-Lyte：BioRad公司；尿素、CHAPS、考马斯亮蓝G-250：Sigma公司；Bradford蛋白质定量试剂盒：上海生工生物工程有限公司。

茯苓菌丝体摇瓶培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸膏 3.5， 蛋白胨 4.5，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5；pH 6.0，121℃灭菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 茯苓菌丝体培养 将50 mL摇瓶培养基装入250 mL锥形瓶，用菌铲挑取于平板生长良好的茯苓“湘靖28”菌丝体数环，接种至摇瓶中，160 r/min、26℃振荡培养4 d作为液体发酵菌种。300 mL摇瓶培养基装入2 L锥形瓶，以10%接种液体发酵菌种，26℃摇瓶转速为160 r/min时培养7 d。发酵液于6 000 r/min离心15 min，收集沉积的菌丝球[14]。

1.2.2 蛋白质的提取 用多层无菌滤纸挤去样品菌丝球中残存的水分，迅速加液氮研磨成粉末，加入预冷的10%三氯乙酸丙酮溶液（含0.07%β-巯基乙醇），混匀，置于-20℃过夜，然后在0～4℃下15 000 r/min离心30 min，去上清液，沉淀用预冷的80%丙酮（含0.07% β-巯基乙醇）重悬，重复沉淀、离心多次，至上清液无色后，沉淀经真空干燥制成蛋白质干粉，再经尿素-硫脲蛋白提取液溶解出菌丝干粉中的蛋白质，按生工公司改良Bradford蛋白质定量试剂盒说明书测定蛋白质质量浓度。取茯苓菌丝体蛋白质200 μg用于IEF（等电聚焦）及SDSPAGE分析。

1.2.3 蛋白质双向电泳 GE公司Multiphor II双向电泳系统。第一向等电聚焦 （Isoelectric focusing，IEF） 在 Ettan IPGphorⅡIEF等电聚焦仪（GE Healthcare）上完成。等电聚焦的样品通过水化上样方式加样。IEF采用13 cm非线性胶条，聚焦程序参照pH3-11NL的IPG胶条的聚焦程序根据操作手册《2-D Electrophoresis principle and methods》设定，SDS-PAGE凝胶浓度为10 g/dL，考马斯亮蓝染色法对胶条染色过夜，用ddH2O漂洗至背景清晰为止。凝胶扫描：UMAX Powerlook 2100xl光密度扫描仪。凝胶分析软件：ImageMaster 2D Platinum。采用ImageMaster 2D Platinum对凝胶中蛋白质点的数目进行分析，符合一个蛋白质点的参数设置为：Smooth：2.0；Min Area：5.0；Saliency：2.0。

1.2.4 蛋白质鉴定 质谱分析在中山大学中山医学院蛋白质组学中心，采用基质辅助激光解吸附电离 （MALDI） 串联飞行时间质谱仪 （MALDI-TOF/TOF）Ultraflex III对选取的10个蛋白质点进行分析，获得二级肽指纹图谱，并进行数据库检索与蛋白质鉴定。检索的数据库包括NCBI数据库（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）， 根据质谱数据，蛋白质得分在73以上，检索结果可信度高（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 双向电泳结果重现性

三氯乙酸丙酮溶液沉淀茯苓摇瓶培养的菌丝体总蛋白质，再经尿素-硫脲蛋白提取液溶解出菌丝干粉中的蛋白质，取蛋白质200 μg用于IEF及SDS-PAGE分析。经多次重复实验，Image Master 2D Platinum软件并结合肉眼分析，蛋白质组表达基本相似，其中的两次IEF及SDS-PAGE分析结果见图1。可以看出，利用该方法获取2-DE蛋白质斑点分辨率高，脱色后所得到的图像背景干净，两次2-DE的结果高度一致，说明利用该方法所得到的2-DE结果重现性较好。

利用pH3-11NL的胶条分离得到的蛋白质点相对分子质量主要集中在50 000～105 000之间，其中，大部分蛋白质相对分子质量在70 000以上，而pH 8以上的碱性蛋白质斑点非常少，相对分子质量在40 000以下的蛋白质点同样很少。采用ImageMaster 2D Platinum对凝胶中蛋白质点的数目进行分析，符合一个蛋白质点数为452个，见图2。

图1 茯苓菌丝体总蛋白质双向电泳考染结果Fig.1 2-DE map stained with coomassie R-250 of Poria cocos mycelium total protein

图2 凝胶中蛋白质点的数目进行分析Fig.2 Protein spots analysis of the coomassie R-250 stained gel

2.2 蛋白质质谱鉴定

所选择的10个蛋白质点见图3，所选蛋白质相对分子质量在100 000以下、等电点在3～11、与其它蛋白质间距较大且丰度相对较高。所选择的10个高丰度表达且相对分子质量较低的蛋白质进行质谱（MALDI-TOF/TOF MS）分析和数据库检索，获得的10个蛋白质点有6个蛋白质得分值在55以上，并在数据库中找到了与之匹配的蛋白质，其中3个蛋白质（3、5和10）在NCBI蛋白质组数据库中得分较高（大于73），这3个蛋白质斑点数的质谱分析结果在数据库中的鉴定结果可信度高，其中得分最高的10号蛋白质点分值达212，10号蛋白质点的质谱分析和数据库检索结果见图3。表1显示了6个蛋白质在NCBI库中鉴定到蛋白质的相关信息，获得身份鉴定的6个蛋白质分别为：60S核糖体蛋白L40、自噬性溶酶体蛋白Apg16、泛素、细胞色素P450、热休克蛋白STI1和真核起始因子-5a。

图3 蛋白质点的选取及质谱分析Fig.3 Protein spots selection and MS analysis

表1 蛋白质的鉴定Table 1 Identification results of selected proteins

3 结 语

蛋白质的提取是双向电泳的第1步，也是最为关键的，决定双向电泳的成败。如果需要研究组织中尽可能多的蛋白质，可以选择TCA-丙酮法，这也是目前应用最广的蛋白质提取方法，本研究采用该方法获得了较好的提取效果[11-13]。第二向凝胶浓度对蛋白质的分离效果影响很大，这就需要确定一个较适宜的分离胶浓度。本研究采用10 g/dL的分离胶浓度效果更好，蛋白质点分布更加均匀，这样在调整好上样量后能够分离到更多的蛋白质，但对于相对分子质量较小的蛋白质10 g/dL的胶质量浓度就显得偏低。经软件分析共得到不到500个蛋白质点，这与蛋白质上样量相对较少、染色和SDSPAGE胶质量浓度等都有关系。本研究主要目的是探索提取真菌菌丝体总蛋白质中常用的三氯乙酸丙酮溶液沉淀结合尿素-硫脲法对茯苓菌丝体总蛋白质提取的适用性，因此蛋白质的上样量相对差异蛋白分析要少得多，而差异蛋白2-DE分析的上样量至少为本研究的5倍以上。三氯乙酸丙酮溶液沉淀结合尿素-硫脲法对茯苓菌丝体总蛋白质提取的重现性好，说明该方法对于茯苓菌丝体总蛋白质的提取同样适用。选取的蛋白质点经质谱鉴定后，6个经鉴定的蛋白质都是组成型表达基因的产物，由于还没茯苓的蛋白质数据库，且已经报道的茯苓蛋白质还非常少，因此数据库检索大部分蛋白质得分较低，只有3种蛋白质的得分在73分以上。另外，茯苓菌丝体总蛋白质谱鉴定结果说明，样本全蛋白质检索需要检测的样品数量大，并且大多数具有应用价值的重要功能蛋白质往往并非是组成型基因表达的蛋白质，通过减少检测样品的数量来提高发现茯苓菌丝体重要功能蛋白质的效率，在后续的研究中，我们将利用不同组分的培养基在不同条件下对茯苓菌丝体差异表达蛋白质进行鉴定，以期发现如纤维素酶、半纤维素素、木质素酶等酶类和其它重要生物活性蛋白质，为茯苓经济价值的深入开发奠定理论与技术基础。总之，本研究为茯苓菌丝体蛋白质组学研究提供了可靠的蛋白质提取方法和较为合适的双向电泳条件，为一下步差异蛋白的鉴定奠定了技术基础。

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