多粘菌素B联合不同抗菌药物对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用

吴正海，刘海洋，陈华乐，段达荣，周铁丽

（1.温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第二医院医学检验中心，浙江 温州 325027；3.台州市第一人民医院 医学检验中心，浙江 台州 318020）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）为条件致病菌，是导致院内感染和社区获得性感染最常见的病原体之一。随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）在全球范围内呈现不断增多趋势，给临床治疗带来极大困难[1]。多粘菌素早期因肾毒性及神经毒性被限制使用，近年来由于多重耐药菌的出现及蔓延被重新启用，被视为治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”。但随着多粘菌素的广泛使用，部分菌株尤其是CRKP中出现多粘菌素耐药性，给临床治疗带来极大挑战。为了有效控制CRKP所致严重感染，防止耐药性的进一步产生，联合用药成为一个较好的选择[2]。本研究采用微量肉汤棋盘稀释法探究多粘菌素B分别与美罗培南和利福平联合用药对CRKP的体外抗菌活性，为临床治疗CRKP感染提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源：收集2016年12月至2017年4月台州市第一人民医院CRKP共20株，菌株收集时剔除同一患者同一部位分离的重复菌株。其中分离自尿液、痰液和血液标本的菌株分别为9株、10株和1株。所有菌株均由VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定并进行药敏检测，琼脂稀释法确认药敏结果。20株菌经改良Hodge实验证实均为产碳青霉烯酶菌株，且其中有15株为多重耐药菌。药敏质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853，均购自卫生部临床检验中心。

1.1.2 仪器和试剂：VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪、DR100型比浊仪（法国生物梅里埃公司），超净工作台（北京东联哈尔仪器公司），96孔平板（上海雷布斯生物科技有限公司）；MH肉汤培养基（济南安贝卡有限公司），无菌接种水、多粘菌素标准品（温州康泰生物公司），利福平（广东华南药业集团有限公司），美罗培南（海正辉瑞药业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液配置：从已经分纯并过夜培养的血琼脂平板上挑取3～5个菌落，并接种于无菌0.9%氯化钠溶液中。菌液用比浊仪调浊度至0.5麦氏浊度，再用MH肉汤稀释100倍。

1.2.2 抗菌药物配置：根据美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准[3]的要求配置各种抗菌药物原液，利福平、美罗培南和多粘菌素B原液浓度均为5 120 μg/mL。

1.2.3 微量肉汤稀释法：将各抗菌药物用MH肉汤进行倍比稀释，制成10个稀释浓度。多粘菌素B浓度为0.5～256 μg/mL，利福平浓度为2.5～1 280 μg/mL，美罗培南浓度为5～2 560 μg/mL。向无菌的96孔平板中每行的第1～第10孔加入100 μL的各浓度药液，再向各孔加入100 μL稀释后的菌液，同时做阴性对照和空白对照。37 ℃培养16～18 h，观察结果并记录各种药物单用时的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值（单药MIC）。重复操作3次取平均值。

1.2.4 微量棋盘稀释法：将各种药物根据2倍MIC值用MH肉汤倍比稀释成8个浓度梯度。分别取多粘菌素B和美罗培南、多粘菌素B和利福平组合，按照棋盘法设计，各取50 μL加入每孔，同时加入100 μL稀释后的菌液，37 ℃培养16～18 h后，观察记录最佳组合时的各药M I C（甲药联用M I C和乙药联用M I C）。并计算部分抑菌·浓度指数（f r a c t i o n a l i n h i b i t o r y concentration index，FICI）值。

1.2.5 FICI计算与判读：FICI=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。FICI≤0.5为协同作用，0.5＜FICI≤1.0为相加作用，1.0＜FICI≤2.0为无关作用，FICI＞2.0为拮抗作用。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析。2组药物组合间的协同率比较采用χ2检验，检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 药物单用和联用对CRKP的MIC比较 多粘菌素B和美罗培南联用后，两者的MIC5（0能抑制50%的细菌所需MIC）与MIC9（0能抑制90%的细菌所需MIC）明显下降：多粘菌素B的MIC50与MIC90均为单药的1/4，美罗培南的MIC50与MIC90为单药的1/32和1/4；多粘菌素B和利福平联用后，多粘菌素B的MIC50与MIC90分别为单药的1/32和1/8，利福平的MIC50与MIC90分别为单药的1/2和1/64。表明上述两种药物与多粘菌素B之间均具有一定的联合效应。见表1。

2.2 浓度-累积抑菌百分率曲线 多粘菌素B与美罗培南、利福平联合用药后，各药物的浓度-累积抑菌百分率曲线均表现为左移，表明各药物组合后的抑菌所需药物浓度与单药时相比均有所降低。见图1-2。

表1 多粘菌素B与美罗培南、利福平单用和联用对CRKP的MIC值（n=20，μg/mL）

2.3 药物联用对CRKP的FICI分布及两药物组合间协同率比较 多粘菌素B与美罗培南联用后，协同作用为55%，相加作用为45%，无关和拮抗作用均为0；多粘菌素B与利福平联用后，协同作用为65%，相加作用为35%，无关和拮抗作用均为0。表明上述两种药物与多粘菌素B组合均有一定的联合效应。各组药物对CRKP的FICI分布见表2。两药物组合间的协同率（协同作用+相加作用）差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 多粘菌素B、美罗培南单用和联用对CRKP的浓度-累积抑菌百分率曲线（n=20）

图2 多粘菌素B、利福平单用和联用对CRKP的浓度-累积抑菌百分率曲线（n=20）

3 讨论

KP属肠杆菌科，为革兰阴性杆菌，对外界抵抗力强，可存在于人体肠道和上呼吸道，一般情况下不致病，在机体抵抗力下降时引发尿路感染、肺炎、菌血症等[4]。碳青霉烯类抗菌药物是治疗多重耐药KP感染的有效手段，然而据我国CHINET细菌耐药性监测报告[5]，CRKP检出率逐年上升，耐药性的获得途径多样，包括产碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失、膜通透性改变和外排泵过表达等，给临床抗感染治疗带来巨大的挑战[6]。因此，以多粘菌素为基础的针对耐碳青霉烯类革兰阴性菌的联合用药方案评价对于临床应用具有重要意义。

本研究通过多粘菌素B分别与美罗培南和利福平联合药敏的方式，对20株CRKP进行体外抗菌活性的研究。结果显示，两药与多粘菌素B联用后，各药的MIC50与MIC90值较单用时有明显降低，累积抑菌浓度百分率曲线明显左移。多粘菌素B与美罗培南联用后，协同作用为55%（11/20），相加作用为45%（9/20），无关与拮抗作用均为0；多粘菌素B与利福平联合用药后，协同作用为65%（13/20），相加作用为35%（7/20），无关和拮抗作用均为0。两种组合均对CRKP具有良好的抑菌作用，且联合抑菌效果相似。BRATU等[7]通过利福平与多粘菌素B联合用药对KP进行抗菌效果评价时发现，16株菌中有15株出现协同作用；亚胺培南与多粘菌素B联合，有10株出现协同作用，3株出现拮抗作用。本研究结果显示多粘菌素B与利福平联合用药的结果与BRATU等的结果基本相同，多粘菌素B与美罗培南联合用药的结果与其报道的多粘菌素B与亚胺培南联合用药结果的差异较大，但与ELEMAM等[8]报道相似，这可能与药物的抗菌效果及菌株特异性有关。TASCINI等[9]研究结果显示多粘菌素B和与利福平联合用药同样对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniaecarbapenemase，KPC）的菌株具有协同作用；QURESHI等[10]的研究表明，多粘菌素B与碳青霉烯类药物的联合应用能降低KPC造成的感染致死率。然而，WAREHAM等[11]体外评价多粘菌素B在与利福平、亚胺培南或阿奇霉素联合用药对多重耐药鲍曼不动杆菌的活性时发现，协同作用不具有普遍性，这可能与菌株特异性及地区差异性有关。

表2 多粘菌素B分别与美罗培南、利福平联用对20株CRKP的FICI分布构成[ n（%）]

与此同时，相关研究显示革兰阴性菌对多粘菌素的耐药率已从0.1%增长到31.0%，并出现了碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌对多粘菌素B耐药的泛耐药菌株，尤以KP最为多见[12]。本研究发现其中两例多粘菌素B单用时的MIC值分别为8 μg/mL和4 μg/mL，需引起高度重视。因此，在控制CRKP感染时需优先选择联合用药，防止多粘菌素耐药的进一步产生。

综上所述，以多粘菌素B为基础的联合用药，既对CRKP产生一定的抑菌效果，又可以降低用药剂量，延缓细菌耐药性的产生，为临床抗感染治疗带来新的选择。此外，应进一步对多粘菌素B及其联合用药的药代动力学（pharmacokinetics，PK）/药效动力学（pharmacodynamics，PD）参数和肾损伤机制及危险因素进行研究，解决以其为基础的联合用药对于临床的有效性和安全性的问题，制定科学合理的用药措施，促使以多粘菌素B为基础的联合用药方案切实成为临床战胜严重感染的有力武器。

[1] 曹慧玲, 舒钊彻, 杨琳, 等. 亚胺培南与舒巴坦联合应用对多重耐药肺炎克雷伯菌的体外试验研究[J]. 实用医学杂志, 2016, 32(3)： 475-478.

[2] LY N S, BULITTA J B, RAO G G, et al. Colistin and doripenem combinations against Pseudomonas aeruginosa: profiling the time course of synergistic killing and prevention of resistance[J]. J Antimicrob Chemother, 2015, 70(5): 1434-1442.

[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;Twenty-fourth informational supplement[S]. M100-S24,CLSI, 2014.

[4] 沈绍清, 任浩洋, 蔡芸. 多黏菌素联合用药研究进展[J]. 中国抗生素杂志, 2016, 41(3)： 166-172.

[5] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等. 2015年CHINET细菌耐药性监测[J]. 中国感染与化疗杂志, 2016, 16(6)： 685-694.

[6] PITOUT J D , NORDMANN P, POIREL L. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae, a key pathogen set for global nosocomial dominance[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(10): 5873-5884.

[7] BRATU S, TOLANEY P, KARUMUDI U, et al. Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY:molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents[J]. J Antimicrob Chemother, 2005, 56(1):128-132.

[8] ELEMAM A, RAHIMIAN J, DOYMAZ M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(10): 3558-3562.

[9] TASCINI C, TAGLIAFERRI E, GIANI T, et al. Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant KPC-producing Klebsiella pneumoniae[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(8): 3990-3993.

[10] QURESHI Z A, PATERSON D L, POTOSKI B A, et al.Treatment outcome of bacteremia due to KPC-producing Klebsiella pneumoniae: superiority of combination antimicrobial regimens[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2012,56(4): 2108-2113.

[11] WAREHAM D W, BEAN D C. In-vitro activity of polymyxin B in combination with imipenem, rifampicin and azithromycin versus multidrug resistant strains of Acinetobacter baumannii producing OXA-23 carbapenemases[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2006, 5(1): 1-5.

[12] 杨德青, 倪文涛, 王睿, 等. 多黏菌素耐药革兰阴性菌研究的文献计量分析[J]. 中国临床药理学杂志, 2016, 32(17)：1617-1620.