慢性低O2高CO2对小鼠海马细胞凋亡、caspase-3和p38 MAPK活性的影响

任惠明，王小同，袁海，康翰林

（1.宁波市第二医院 康复医学科，浙江 宁波 315010；2.温州医科大学附属第二医院 脑科康复中心，浙江 温州 325027；3.合肥市第二人民医院 康复医学科，安徽 合肥 230011；4.赣南医学院第一附属医院 神经内科，江西 赣州 341000）

慢性低O2高CO2普遍存在于慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）等呼吸系统疾病患者中。COPD患者可伴有明显认知功能障碍，增加COPD患者急性加重的风险，导致日常活动受限，增加住院率和病死率[1]。OSAS患者也存在认知功能损害，尤以记忆功能减退为突出表现[2]。慢性低O2高CO2模型可以模拟这类疾病的病理生理过程，进一步研究该类疾病引起的认知功能障碍[3-4]。已有研究发现海马细胞凋亡可能是慢性低O2高CO2导致脑功能损害的重要机制之一[5]，但具体机制尚未明确。p38 MAPK属于应激激活的蛋白激酶，参与了多种因素所致的神经细胞凋亡，是近些年研究的热点[6]，caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶之一。本研究通过建立慢性低O2高CO2小鼠模型，观察海马细胞凋亡以及p38 MAPK、caspase-3活性情况，初步探讨慢性低O2高CO2模型小鼠海马细胞的凋亡机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：雄性C57BL/6小鼠24只，9～10月龄，体质量26～28 g，温州医科大学实验动物中心SPF条件下繁殖，动物使用许可证号：wydy 2012-0079。

1.1.2 仪器和试剂：常压低O2高CO2舱（温州医科大学肺心病研究室制），CYESIl型O2、CO2气体测定仪（上海市嘉定学联仪表厂），荧光显微镜（日本奥林巴斯公司），酶标仪（美国ABI公司）。兔抗鼠磷酸化p38 MAPK、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗、β-tublin抗体均购自美国Cell Signal Technology公司，caspase-3活性测定试盒、细胞凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：雄性C57BL/6小鼠24只随机分为2组，分别为正常对照组（NC组）、低O2高CO24周组（4HH），每组12只。参照文献方法[7]，将4HH组小鼠置于常压低O2高CO2舱内，通过N2调节舱内O2浓度维持在9%～11%，CO2浓度为5.5%～6.5%，每天8 h，每周6 d。其余时间与NC组在同一室内（室温15～20 ℃，相对湿度50%～70%），持续4周。

1.2.2 取材：造模结束后腹腔注射戊巴比妥钠行全身麻醉，仰卧固定，0.9%氯化钠溶液心脏灌注，断头，剥离颅骨，快速分离海马，取左半放入液氮保存，右半放入4%多聚甲醛中固定，分别用于p38 MAPK、caspase-3活性测定和凋亡指数（apoptosis index，AI）测定。

1.2.3 海马CA1区细胞AI检测（原位缺口末端标记TUNEL法）：石蜡切片常规脱蜡、水化，按照试剂盒说明书操作，荧光显微镜观察，有荧光显示者为凋亡细胞。每张切片随机取5个视野，记录凋亡细胞数，AI用凋亡细胞数/100表示，同一张切片由3名不同实验人员读数，并取平均值。

1.2.4 caspase-3活性检测：按照caspase-3活性检测试剂盒说明书操作，取海马组织称重，每10 mg组织加入100 μL裂解液，冰浴匀浆。匀浆液转移到1.5 mL离心管中，冰浴裂解5 min，4 ℃ 20 000转离心15 min。将上清、反应缓冲液、底物（AC-DEVD-ρNA）加至酶标板37 ℃孵育1 h，酶标仪405 nm波长测定吸光度（A）值，重复测量3次取平均值。

1.2.5 Western blot检测海马p-p38 MAPK蛋白含量：蛋白裂解液提取蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Pierce公司）测定蛋白浓度，依次进行SDSPAGE电泳（10%分离胶、4%浓缩胶）、转膜、封闭，孵育盒中注入5% BSA稀释的兔抗鼠磷酸化p38 MAPK单克隆抗体（1∶500）及内参β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育过夜之后注入HRP标记的羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育2 h后化学发光检测试剂反应5 min，接着在暗室中用X胶片感光，然后显影90 s，最后定影3 min。Quantity One凝胶软件系统分析磷酸化p-p38 MAPK和内参β-actin光密度值，蛋白磷酸化p38 MAPK条带光密度和内参β-actin光密度比值代表p-p38 MAPK的光密度值，重复3次独立试验。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0分析软件进行数据处理。所有数据进行正态性检验，正态性计量资料以 ±s表示；多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较用Levene进行方差齐性检验，方差齐用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海马细胞AI NC组偶见细胞凋亡，AI为1.23±0.32，4HH组细胞凋亡较NC组明显增加，AI为7.38±1.29，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。2.2 海马caspase-3活性 NC组caspase-3活性偏低，为0.0205±0.0035，4HH组caspase-3活性较NC组明显增加，为0.0718±0.0085，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 海马p-p38 MAPK蛋白含量 NC组p-p38 MAPK相对蛋白含量较低，为0.25±0.022，4HH组p-p38 MAPK相对蛋白含量为0.46±0.052，较NC组明显增加，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图1 2组小鼠海马凋亡细胞（TUNEL，×400）

图2 2组小鼠海马p-p38 MAPK的表达量

3 讨论

MAPK是哺乳动物体内重要的细胞信号转导系统，一般位于胞浆，受刺激后磷酸化而活化，然后进入细胞核内，通过激活靶基因而参与细胞生长、发育、分化以及凋亡等病理生理过程，MAPK家族成员主要有Erk1/2、JNK、p38以及Erk5[8]。p38是由360个氨基酸组成的38 kD的蛋白，可被多种应激反应激活，因此与JNK一起被称为应激激活的蛋白激酶，可通过多种途径介导细胞凋亡[6]。在脑缺血缺氧模型中p38及JNK通路均被激活[9-10]。研究[11]发现慢性低O2高CO2小鼠海马神经细胞内JNK表达较正常对照组明显增加，本研究发现慢性低O2高CO2模型小鼠海马磷酸化p38 MAPK蛋白表达明显升高，因此慢性低O2高CO2模型动物海马中JNK、p38通路均被激活。

caspase-3被称为细胞凋亡的最终执行者，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是多种凋亡途径的共同下游部分[12]。本研究发现慢性低O2高CO2模型小鼠海马AI较对照组明显增高，与之前研究结果[5，13]相一致，而且慢性低O2高CO2模型小鼠海马caspase-3活性也较对照组明显升高，因此本研究进一步在分子水平证明慢性低O2高CO2模型小鼠海马存在神经细胞凋亡。

p-p38 MAPK可以通过多种途径调控细胞凋亡，其中包括激活caspase家族成员[14]，慢性低O2高CO2可引起小鼠海马细胞凋亡增加，caspase-3活性升高，p-p38 MAPK蛋白表达增强。因此促进p-p38 MAPK蛋白表达进而促进caspase-3活化可能是慢性低O2高CO2模型小鼠海马细胞凋亡的机制之一。

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