高通量测序在新生儿遗传性疾病诊治中的应用

王丹 滕懿群 黄蓉

2015年美国总统奥巴马在年度国情咨文演讲中提出了“精准医学计划”[1-2]，这一概念的提出将“遗传医学-基因组学-个体化医学”的发展提升到前所未有的高度。目前在“精准医学计划”的具体实施过程中，儿童遗传性疾病是最具实践意义的方向之一。最近几年基因组学的发展，使许多遗传性疾病的诊断与治疗正经历着革命性的变化。随着分子生物学技术的飞速发展，特别是基因组学的兴起以及测序技术的快速发展，使我们对遗传性疾病的认识由细胞水平进入分子水平，对众多疾病的发病机制有了新的认识，在诊断、治疗和预防方面开辟了新的途径。目前，高通量测序已发展为遗传性疾病诊断的首选方法。该技术可以在分子水平准确进行疾病诊断与分型，在某些方面，优于一代测序、串联质谱-气相色谱检测[3]等其他检测技术，但也存在一定局限性。

高通量测序，即下一代测序，也称大规模平行测序、二代测序，是近几年诞生的全新DNA测序技术，它能同时对几十万甚至几百万DNA分子进行平行测序，主要特点是边合成边测序，与传统的一代测序技术（Sanger测序）相比，具有高通量及高敏感性等优势。高通量测序主要是待测序的片段化的基因组DNA与通用的接头连接，然后通过不同的方法产生成千上万的单分子多克隆聚合酶链反应

（PCR）阵列，并进行引物杂交和酶延伸反应，这些反应可以同时对几十万甚至几百万DNA分子进行平行测序，最终得到的测序数据经软件分析可获得较完整的DNA序列信息[4]。目前高通量测序的主要平台代表有瑞士罗氏公司（Roche）的 454测序仪（Roche GS FLX sequencer），美国ABI的 SOLiD 测序仪（ABI SOLiD sequencer）和美国 Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）[5]。本文就近几年高通量测序在新生儿遗传学疾病诊治的应用方面进行综述，为疑似遗传性疾病的疑难、危重新生儿提供诊治新思路，提高整体的诊治水平。

1 高通量测序的方法和技术原理

1.1 Roche/454 454公司首先将焦磷酸测序应用在测序技术上，之后被Roche诊断公司收购，形成了目前的Roche/454。主要是将待测DNA样品打断成300～800bp的片段后，在3'和5'端分别加上接头，这些接头会使DNA片段结合到磁珠上，并形成样本文库。再将包含磁珠和扩增试剂的水溶液注入矿物油中，称为“小水滴”，即形成油包水结构，每个小水滴只包含1个DNA模板。扩增反应在此结构中单独进行。扩增后，DNA分子富集，磁珠上进行焦磷酸反应，反应结束后每个磁珠只能形成1个读长，通过GS-FLX系统分析，将引物上脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的聚合与荧光信号释放偶联，通过检测荧光信号，进行DNA测序。Roche/454测序仪的测序通道体积非常狭小，只能容纳1个微珠。相对其他2种测序方法，其具有测序读长长的优点，可以提供中等的读长和适中的价格，适用于新物种基因组、转录组测序等，但也可能产生误差[6]。

1.2 ABI/Solid 其技术的核心是4种荧光标记寡核苷酸的连接反应[7]。在文库构建和PCR扩增方面，和Roche/454基本相同，测序之前，DNA模板通过乳化PCR扩增，只是ABI/Solid的微珠更小，只有1μm。连接测序所用的底物是8个碱基荧光探针混合物，根据序列的位置，样品DNA就可以被探针标记。DNA连接酶优先连接和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。其优点在于读长只有50～75bp，精确度可达Q40，适于基因组重测序和单核苷酸多态性（SNP）检测。ABI/Solid系统在测序过程中对每个碱基判读2次，从而减少原始数据错误；使用连接酶替代聚合酶，能明显减少因碱基错配而出现的错误；测序过程中由于存在更换引物，可以减少错误率，确保精确度，是目前下一代基因分析技术中准确度相对较高的。

1.3 Illumina/Solexa 其测序核心是“DNA簇”和“可逆性末端终结”，原理是可逆性终止化学反应[8]。DNA片段两段加上接头之后，可固定到芯片表面，形成DNA文库，芯片表面连接与接头互补的寡核苷酸，形成桥结构（即DNA簇），进行PCR扩增。扩增后形成的数千份相同的单克隆DNA簇被用作测序模板。测序时利用“可逆终止子”进行边合成边测序的方法，直至测序结束。由于测序过程是可逆的，保证了测序的准确性，有效减少错误掺入，且成本相对低，适用于小RNA测序、甲基化、全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）等。

目前，高通量测序已经越来越多地应用于临床实践领域[5，7]。高通量测序按照测序覆盖范围大小大致分为以下几种：WGS、全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）、靶向目标基因测序。其中WGS能对基因组水平的变异作最全面和深入的研究，但由于目前所需费用较昂贵，海量测序数据的储存和分析难度较大等原因，暂时未能在实验室得到广泛应用。一些原理验证研究已证实WES应用于临床诊断是可行的，且在遗传性疾病的诊断方面体现出强大的优势，目前已经成为疾病基因研究和分子标志物发现的重要工具[9]。靶向目标基因测序通过对疾病所有已知相关的致病基因作单管平行检测，能最大限度地发挥高通量测序在遗传性疾病领域的优越性，同时很大程度上可避免WGS和WES产生的大量数据对下游生物信息学分析和解读造成的困难，因此非常适合临床实验室对罕见遗传性疾病进行分子诊断[10]。

2 高通量测序与新生儿遗传性疾病

遗传性疾病是指由于人体遗传物质结构或功能发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病[11]，这类疾病通常因基因突变所致。基因的内部结构及功能极其复杂，对损伤极其敏感，在损伤中基因通常容易发生突变，从而导致疾病的发生。遗传性疾病一般分为5大类：染色体病、单基因遗传性疾病、多基因遗传性疾病、线粒体病、基因组印记[12]。根据在线人类孟德尔遗传数据库统计，目前已报道的单基因遗传性疾病（表型）约有7 000多种，其中已明确致病基因的约4 000多种。遗传性疾病在儿科临床诊疗工作中十分常见，涉及范围极为广泛，尤其是新生儿科。遗传性疾病在新生儿重症监护病房的比例也逐渐增高，保守估计中国目前有1 000万余罕见病患儿，同时每年约有90万存在出生缺陷的孩子出生，其临床症状及致病原因极为复杂。笔者在临床工作中发现，疑难、危重新生儿越来越多，往往诊断困难，治疗效果欠佳，而此类患者往往是遗传性疾病患者的重要组成部分。

近些年来高通量测序逐渐成熟，2009年，Ng等[13]首次报道了WES用于临床诊断的研究结果。目前高通量测序广泛应用于各个领域，如肿瘤[14]、临床样本检测[15]、基因检测[3]、遗传性疾病[4]等，已经成为临床研究领域的重要工具。并且在儿童遗传性疾病方面的应用，已进行了初步的尝试，证实其在新生儿疾病精准治疗领域具有可行性。就现状而言，高通量测序在新生儿领域的应用主要针对神经系统疾病、发育异常、先天畸形、代谢异常、合并多脏器功能损伤等，并且常用于筛查无法诊断的疾病或者结合患儿病史、家族史考虑存在先天性遗传性疾病可能的患儿。

2.1 高通量测序在遗传代谢性疾病（IMD）中的应用IMD是新生儿期常见的一类先天性疾病，是指由于各种因素所致代谢障碍和（或）中间产物堆积引起的一组疾病，临床表现多样化且复杂，发病时间早，进展迅速，病死率较高，部分疾病早期发现并加以治疗可以有效延缓病情进展，因此早期干预尤为重要。1960年国外学者提出进行IMD的筛查，由此拉开IMD筛查的序幕。随着技术、经济水平的发展，筛查项目范围不断扩大，手段日益丰富，目前针对IMD高风险患儿气相色谱－串联质谱（GC-MS/MS）检测技术是继干燥纸片法之后最为常用的手段之一，但也存在漏检、检测结果与临床不一定完全匹配等缺点，因此急需挖掘更为准确的检测工具，以便进行更有针对性的治疗。近年来，国内多家医院和医学研究机构利用高通量测序辅助IMD患儿的诊断。杨琳等[16]利用Ion Torrent PGM TM平台对1例胆汁酸合成障碍（例1）、1例甲基丙二酸血症（例2）患儿外周血标本进行靶向目标基因测序，针对例1检测到相关HSD3B7基因c.45-46delAG和c.262G＞G/C的复合杂合突变，以及AMACR 4个SNP，与多重连接探针扩增技术和Sanger测序结果一致；针对例2检测到相关MUT基因 c.728-729het-insTT、c.636G＞G/A、c.2011A＞A/G这3个突变与验证结果一致。此手段在具有极高灵敏度的同时又具有以下优点：测序所需时间较短、成本低；主要由机器操作，节省人力；且数据分析相对简单，结果直观；不仅包括突变也包括SNP。针对研究中检测到2个假阳性的现象考虑可能为测序过程中干扰所致，需要进一步提高检测技术水平、数据处理和技术分析能力。郝虎等[17]对经GC-MS/MS检测的疑似阳性的10例IMD患儿利用基于目标基因的捕获测序方法进行基因测序，结果显示经Sanger测序验证8例得到确诊，其中3例得到准确分型，这为患方和临床医生提供了精确的基因检测结果，并且为疾病的治疗、后期的管理提供了充分的依据，因此高通量测序非常适合用于IMD的诊断。IMD也是不断认识的疾病，虽然目前高通量测序检测到一些尚不能确定为致病突变的变异，但是可以进一步研究与疾病的相关性如严重程度、分型等，可以收入基因库，作为日后疾病研究的基础。

韩国曾对新生儿疾病筛查结果呈阳性的269个患儿进行高通量测序[18]，筛查97个相关基因变异情况，20%确诊为IMD，值得注意的是，此研究发现了新的可预防的IMD患儿，通过早期干预避免可能出现的严重后果。此研究建立的疾病筛查的模型有助于更快更精确诊断IMD，显示高通量测序在筛查中的重要地位。

随着技术革新，溶酶体病诊断方法也在逐渐优化。高通量测序的出现弥补了GC-MS/MS、快速干燥纸片采血法的缺陷，有利于诊断疑难病例，揭示常见的基因突变，发现新的致病基因，扩充疾病表型[19]。

研究表明高通量测序对囊性纤维化的诊断具有较高的阳性预测值、灵敏度和特异度等优点，检测结果可以更加有效指导临床[20-21]。苯丙酮尿症（PKU）是新生儿较为常见的IMD之一，PAH基因突变最为常见，陈瑛等[22]等运用目标序列捕获二代测序技术对PKU患儿进行PAH基因检测，发现有7种错义突变、2种无义突变、3种剪接突变和3种非致病性变异，其中2种为新发现的可疑致病突变。由于检测结果定位到具体变异位置，明确病因，为基因治疗提供依据[22]。

上述研究表明在IMD的诊治中高通量测序所具有的独特优势，因而得到广泛应用。

2.2 高通量测序在先天性畸形中的应用 2015年，复旦大学附属儿科医院通过参考以往的数据分析及相关文献，与美国贝勒医学院合作，结合实际操作经验，创建了一套高通量测序数据分析和临床诊断流程[23]，包括测序数据预处理、变异检测、变异注释、变异筛选和变异分类等。他们将理论转化为实践，应用此流程，对复旦大学附属儿科医院收治的87例多发畸形新生儿进行WES分析[24]，得到的结果与目前的结论一致。对比贝勒流程，此流程灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均≥96.66%。当然由于变异注释使用的数据库以及设置的频率筛选阈值不同，最终结果与贝勒流程存在一定交叉。这为临床医师如何应用高通量测序进行了良好的示范。

2015年，Lim等[25]利用目标基因探针捕获技术对15例存在先天性缺陷的患儿进行基因检测，其中6例检测出致病基因，检出率达到40.0%；另外5例筛选出候选基因，并正在进一步研究中。研究成果表明，针对有目的性致病基因的患者，此技术在检测成本、分析难度、花费时间等各方面均具有明显的优势。Carss等[26]通过对30例孕妇基因的WES研究发现，此技术可以准确识别致胎儿畸形的基因突变，可以为孕妇及其家庭提供产前咨询，不过距离临床广泛应用还存在一定距离。

新生儿胆汁淤积症原因众多，但遗传性因素是较为常见并且后果严重的病因之一。新生儿胆道闭锁是常见的胆道先天畸形的一种，主要以肝内和肝外胆管进行性炎症和纤维性梗阻为特征，最终导致肝衰竭的疾病，是肝移植的最常见指征[27-28]。2016年，彭小芳等[29]为了分析胆道闭锁患儿外周血中循环miRNA的表达特征，寻求新的疾病诊断标志物，对26例患儿血标本提取的miRNA采用Illumina Hiseq测序，研究结果全面展示了患儿miRNA的表达情况，探索异常表达的miRNA是否可以作为胆道闭锁无创诊断的参考标志物，此方法灵敏度较高，检测结果较常用的芯片技术精确，并且可以检测新的未知的miRNA序列，具有很大的临床应用价值。Alagille综合征是较为罕见的造成肝内胆汁淤积症的常染色体隐性遗传病，常为散发，临床表现不典型，极易误诊、漏诊，且后果严重，目前诊断依赖特征性症状、体征。高美玲等[30]利用目标基因捕获4例Alagille综合征患儿进行基因检测，结果不仅得到Sanger测序验证的肯定，而且确定了JAGl基因致病性突变，其中3例为错义突变 ，e．839C ＞T （P．W280X）、C．703G ＞A（P．R235X）、e．1720C＞T（P．V574M），1 例为插入突变，c．1779-1780insA（p．Ile594AsnfsTer23），经家系验证及家族史追踪，发现此突变来源于母亲，从而可以提供遗传学咨询。上述其中2种突变为新发现致病突变，意义重大。

2.3 高通量测序在血液系统疾病中的应用 儿童血液系统疾病较其他系统疾病少见，但通常归属于疑难、重症、易复发类，且往往与遗传性因素有关。血友病A是常见的凝血异常疾病，目前通过测定F8因子活性确诊，但不能提供遗传学信息，也不能检测先证者是否存在携带，给血友病A患儿家庭带来极大的困扰。刘安等[31]利用Ion Torrent平台对9例F8因子基因突变的血友病A患儿进行高通量测序，发现基因突变具体位点，并对家系成员进行检测，其中1例携带者孕妇的胎儿产前基因检测结果显示阴性。

嗜血细胞性淋巴细胞增多症（HLH）进展迅速，诊断较难，致死率较高。Tesi等[32]通过对HLH及正常人群进行HLH相关基因的靶向高通量测序，为HLH基因诊断提供平台，研究结果有助于解读基因突变的因果关系及环境对基因突变的影响，但过程复杂，仍需要进一步探索。

一些唐氏综合征患儿被诊断出有自限性暂时性骨髓增生异常综合征（TMD），20%～30%可发展为急性巨核细胞性白血病（AMKL）。Nikolaev等[33]对 7例 TMD/AMKL患儿采用WES，同时所有患儿均进行拷贝数分析，研究显示所有TMD/AMKL患儿均有GATA1突变。高通量测序可以在明确致病原因的同时，为家庭成员提供遗传咨询，指导生育。

2.4 高通量测序在其他遗传性疾病的应用 虽然科学技术日益发达，但由于基因组的庞大和复杂，目前有限的医疗水平尚不能满足对疾病的完全认识，还有很大一部分疾病等待人类的发掘和探索。先天性成骨不全（OI）是罕见的遗传性疾病，主要表现为骨质疏松、骨脆性增加、蓝眼珠等，不同分型OI，症状严重程度不同，其中Ⅱ型较重，但难以确诊，且发病机制不明。Maasalu等[34]通过检测700多个先证者及其父母基因组DNA序列，阐释了Ⅱ型OI的致病机制，分析了基因型与表型之间的关系，并且发现了新的可疑致病突变；多发先天性畸形-肌张力低下-癫痫综合征1（MCAHS1）是遗传性糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定缺陷疾病，2011 年首次报道[35]，GPI广泛参与机体各个生命活动，由其引起的疾病表型常常多样化。胥雨菲等[36]利用靶向目标基因测序对1例MCAHS1患儿进行基因测序，并通过Sanger测序验证高通量测序结果以及父母携带情况，结果显示存在PIGN基因的复合杂合变异，目前国内尚无类似报道，同时结合国外相关文献，总结了该病的临床特点、遗传学知识、诊治要点等，加深广大医务工作者对此疾病的认识。显示了高通量测序在某些罕见遗传性疾病领域研究中的极高价值。

大多数弱智儿在新生儿期往往无明显临床征象，目前认为该病具有遗传异质性。Redin等[37]对106例智力低下及自闭症患儿进行靶向目标基因测序，分析217个已知突变与临床表型的关系，敏感度达到25%，并且发现了新的突变点，阐述了基因型与表型的关系，这使得我们对基因变异的认识由躯体疾病扩展到心理健康层面。

免疫缺陷病往往和遗传因素挂钩，具有明显的遗传倾向性，患儿新生儿期常表现为反复、难控性感染，远期影响深远。Erman等[38]研究设计了HaloPlex探针捕获方法，对土耳其19例临床诊断为重度联合免疫缺陷病（SCID）患儿进行测序，此探针涵盖了356个原发性免疫缺陷病（PID）以及至少97.3%已知SCID相关基因，最终发现可疑致病的8个突变，检出率高达32%。进一步研究显示经Sanger测序确定致病的患儿中，所有已知基因突变均得到验证，同时发现了之前未曾报道过的可疑突变。共济失调毛细血管扩张症（AT）是PID的一种特殊类型，新生儿期可表现为T淋巴细胞减少等。Mallott等[39]通过高通量测序方法探索T淋巴细胞减少有关的基因突变，发现与AT基因突变存在一定联系。这提示探针捕获是快速诊断免疫缺陷病基因的手段，同时可为临床表型复杂的患儿提供精准的基因诊断结果，有效指导临床。

长QT间期综合征引起的致命性心律失常是儿童猝死的重要原因之一，实现早期分子诊断有助于评估风险，有效改善预后。Priest等[40]对10天龄新生儿采用WGS，短时间内找到致病突变来源，可为患儿提供更及时、可行性更高的诊治方案。

此外，新生儿筛查计划（NBS）主要目标是有针对性的筛查出高度可预防或可治疗疾病的基因变异，有关组织提出高通量测序在NBS中应用的可行性、可能存在的问题、需遵循的规章及注意事项等，为科研学者、临床医师提供指导[41]。向萍霞等[42]研究表明通过对孕妇血浆或羊水的胎儿微量DNA进行高通量测序，可以检测胎儿21、18、13号染色体非整倍体异常，灵敏度达到100.00%，特异度99.91%。这为胎儿产前无创性检查提供了新的方法，实用性较强。

3 展望与挑战

伴随着人类基因组计划的完成，“精准医学计划”的提出，基因测序技术应时代要求不断在发展。精准医学的基础是精准诊断，要想实现精准诊断，就要求达到精准检测，而基因检测就是其主要手段。随着测序技术的发展，人类基因组完整序列数据的获得所需成本和时间大大的减少，高通量测序应运而生，在实验室分析研究以及临床疑难病诊治等方面具有广阔的临床应用前景。

高通量测序是近十几年来新兴发展的新一代基因检测技术，与Sanger测序方法完全不同，具有测序速度快、测序范围广、灵敏度高、精确度高、相对成本低等优势，随着技术的革新，高通量测序水平逐步走向成熟，越来越多的应用于各个领域，尤其是遗传性疾病的诊治方面。近年来“二胎政策”的开放使产科、儿科医师面临巨大的挑战，随着医疗水平不断提高，医务工作者对疾病的认识也不断深入，很多以往诊断不明甚至死亡的病例逐渐被认识，往往其中很大一部分属于遗传性疾病，但由于基因的庞大以及检测技术的限制，早期通常难以实现明确诊断。高通量测序的出现对此类疾病来说是非常积极有效的诊断手段。高通量测序为疑难、危重且高度怀疑遗传性疾病提供相对简单、精准的检测方法，在明确诊断以及分型的同时，更有可能发现新的致病基因，丰富遗传性疾病基因谱，了解发病机制，为治疗提供准确的方向。通过对其家系成员验证，预测患儿父母下一代子女患同样疾病的风险，提供遗传咨询，也在一定程度上避免医疗纠纷。

虽然高通量测序具有以上优势，但也并非“无所不能”和“统一适用”。从适用人群看，针对那些具有典型临床表现、候选基因单一的疾病，可以直接选用Sanger检测，而高通量测序对那些高度怀疑有遗传性疾病可能、常规手段不能诊断、需要尽快明确病因的疑难、危重病患者则是非常重要的检查手段，但是需要与患者家属进行详细的沟通和解释，征得家属同意。从经济角度看，相对其他普通检测手段，费用偏高，不过随着技术革新、经济水平提高，相信费用已不是主要限制因素。从技术层面看，高通量测序整个操作、分析过程相对复杂，从DNA提取、制备基因组文库、PCR扩增、不同测序方法得到测序数据，再进行软件分析、筛选变异、结合数据库分析、得出结论，所需时间稍长，一般约4～6周。由于技术本身测序原理（除WGS外）为不连续捕获、读长相对短等，针对微小缺失、重复造成的拷贝数变异检测能力不高。另外不同的平台测序技术、软件分析水平也存在差异，可能影响最终结果，存在假阳性可能，结果需要一代测序进行验证。尤其是生物学信息分析环节，对技术员个人水平要求较高，同样的测序结果，不同分析人员得出结论可能不同。研究员需要具备丰富的遗传学知识和较高的医疗技术水平，实现理论与临床实际的结合，才能得到最精准的检测结果。另一方面，第三代、第四代测序技术的出现，因具有成本更低、读速更快等优点[41]，使得高通量测序需要不断自我提升来占有一席之地。总而言之，高通量测序仍面临严峻挑战。

总体来说，就目前的国情、发展趋势，高通量测序仍旧是目前儿科遗传性疾病首选的诊断方法，但由于各种因素影响，要实行普遍推广还需要继续努力。

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