FTIR结合化学计量学快速预测铁皮石斛中总多糖含量

曾 贞，孙 恒*，陈骏飞，徐天才，王宇萍，李 坤，康平德**，胡 强

(1.云南省农业科学院 高山经济植物研究所，云南 丽江 674199；2.云南省农业科学院 热区生态农业研究所，云南 元谋 651300；3.云南省农业科学院，云南 昆明 650000)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，主要分布在我国云贵、两广、浙江、湖南等地区[1]。有研究表明：铁皮石斛含有丰富的多糖、芪类、黄酮、多酚等多种化学成分[2-5]。《中国药典》记载：具有益胃生津，滋阴清热之功效；用于热病津伤，口干烦渴等症[6]。现代药理学认为：铁皮石斛多糖具有提高机体免疫能力[7]、抗氧化[8]、抗疲劳[9]、抗肿瘤[10]等药理活性。多糖作为评价铁皮石斛质量的指标性成分，对其含量预测具有重要意义。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)为分子振-转光谱，能够提供丰富的峰位、峰强和峰形信息，具有加合性，反映药材整体质量，克服单方面定性和定量研究的不足，有红外光谱指纹图谱和全息光谱之称特征性强、快速、无损和简便等优点，能够反映样品化学成分整体信息[11]，Luís M等[12]基于傅里叶变换近红外光谱对废弃咖啡中咖啡因、咖啡酸、儿茶酸、绿原酸和茶碱的定量分析，结果偏最小二乘回归分析(PLSR)模型预测集相关系数Rp2分别为0.95、0.92、0.88、071、0.84，表明能良好预测废弃咖啡中相关成分含量，Daniela等[13]用FTIR鉴别塑料、薄膜和泡沫，结果显示：PCA分析能很好地区分3种样品；杨天伟等[14]用FTIR建立马氏距离分类模型及偏最小二乘判别分析快速鉴别不同种类牛肝菌，结果显示：MSC+SD+ND(15∶5)和SNV+SD+ND(15∶5)2种预处理的验证集和预测准确率分别为90%和95%，此外，红外光谱还广泛运用于食品[15-16]和中药[17]的鉴定及预测分析中。紫外光谱为电子光谱，常用于水质[18]、食用油[19]、饮料[20]、中药[21]的定量测定及质量控制分析，但其操作繁杂，存在化学污染。

本研究运用紫外可见分光光度计测定不同采收时间的样品粗多糖吸光度，同时使用红外光谱采集样品光谱数据，拟合紫外、红外数据，用FTIR结合化学计量学对铁皮石斛多糖进行了快速预测。建立快速的铁皮石斛粗多糖预测模型，为企业采收铁皮石斛和生产线石斛多糖质量控制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取种源相同的铁皮石斛种苗，并经笔者反复核实鉴定为铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)，2011年4月定植于玉溪市红塔区祥馨农产品种植基地，2014年1～12月的每月15日采收鲜条，60 ℃鼓风干燥5 d，粉碎过60目筛备用。

1.2 仪器与试剂

Perkin-Elmer Fronter型傅里叶红外光谱仪，DTGS检测器，光谱范围4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，信号累加扫描16次。压片机为YP-2(上海山岳科学仪器仪器公司)。UV─2550双通道紫外可见分光光度计，配有UVprobe工作站使用说明书，由日本岛津公司生产。KBr为分析纯，购于天津市风船化学试剂科技有限公司。H2SO4为分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂。CH3CH2OH(无水乙醇)，为分析纯，购于西陇化工股份有限公司。无水葡萄糖超纯级CAS:50-99-7，购于Sigma-Aldrich公司。C6H5OH(苯酚)为分析纯，购于西陇化工股份有限公司。

1.3 红外光谱扫描

取样品与KBr粉末(1∶100)混合研磨均匀，压制均匀成透明薄片，放入红外光谱仪中测定。红外光谱采集过程中室温保持在25 ℃，空气相对湿度保持在40%～48%。

1.4 铁皮石斛总多糖的测定方法

1.4.1 标准溶液制备 取无水葡萄糖对照品18 mg，精密称取，加水定容制成90 μg/mL的溶液。

1.4.2 标准曲线制作 精密量取标准溶液0.1～1.0 mL分别放置于试管中，用移液枪补超纯水至1.0 mL，加5%苯酚1 mL，摇匀，加硫酸5 mL摇匀，沸水水浴20 min，取出，冷水浴5 min，以相应试剂为空白，进UV─2550紫外光度计，测量吸光度，对比样品和标准品，确定最适吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.3 样品多糖溶液制备 取过60目筛的样品粉末(0.0600±0.0001) g，加超纯水30 mL水浴超声2 h，过滤，取滤液2 mL，加无水乙醇至20 mL，冷却过夜12 h，4000 r/min离心20 min，弃上清液，加80%乙醇溶液至20 mL洗涤除去单糖影响，4000 r/min离心10 min，弃上清液，水浴挥干乙醇，加水定容至40 mL，即得。

1.4.4 样品多糖含量测量 用移液枪精密移取0.5 mL样品溶液置于试管(50 mL具塞试管)中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，加入硫酸5 mL，依上述方法测定吸光度，计算得粗多糖含量。

1.4.5 方法学考察 (1)重复性试验精取5份某一样品配制溶液取0.5 mL，按1.4.2操作，测定吸光度，计算吸收波长的相对标准偏差(RSD)，考察其精密度。

(2)稳定性试验精取某一样品溶液0.5 mL，按1.4.2操作，分别在0、1、2、3、4 h测定吸光度，计算吸收波长的相对标准偏差(RSD)，考察其稳定性。

(3)精密度试验精取某一样品溶液0.5 mL,按1.4.2操作，重复5次测量吸光度，计算吸收波长的相对标准偏差(RSD)，考察其精密度。

1.5 数据预处理及建立预测模型

运用UV-2550双通道紫外可见分光光度计自带的UVprobe工作站选择数据，在Excel 2003软件中做出标准曲线：y=0.0079x+0.027，R2=0.9995；利用回归方程结合样品吸光度计算样品中总多糖含量，进行方法学考察。使用OMNIC软件对红外光谱数据进行基线校正，纵坐标归一化等预处理。导入SIMCA-P+11.5软件进行Savitsky-Golay平滑(SG)、一阶导数(First Derivation，1D)、二阶导数(Second Derivative，2D)、标准正态变量校正(Standard Normal Variable，SNV)、多元散射校正(Multiplicative Signal Correction，MSC)、正交信号校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)等组合处理，进行偏最小二乘回归建模。

2 结果与分析

2.1 样品红外光谱分析

根据1.3中的试验方法，扫描样品的傅里叶红外光谱，从图1可以看出：1～12月，铁皮石斛在不同采收月份的原始图谱特征峰相似，采收的铁皮石斛的峰位置一致，峰高存在差异，意味着化学成分一致，但含量有所不同。其中3400 cm-1附近主要为O-H伸缩振动；2924 cm-1附近主要为烷烃C-H的伸缩振动；1800～1500 cm-1波段主要包括C=C、C=O、C=N等伸缩振动以及苯环的碳骨架环内振动；1500～1300 cm-1波段信息主要代表了C-H的弯曲振动；1300～910 cm-1波段是单键的伸缩震动区以及部分含氢基团的弯曲振动；910 cm-1以下波段主要包括苯环面外弯曲振动与环弯曲振动，烯的碳氢弯曲振动等。红外光谱记录了样品中多糖类化合物O-H、C=O、C=C、苯环等多种键位的化学信息，这为利用红外光谱对铁皮石斛中总多糖进行快速预测提供了理论基础[11,22]。

图1 铁皮石斛样品的红外光谱

2.2 多糖含量计算

按1.4条件下采集铁皮石斛样品、样品+葡萄糖、葡萄糖的紫外光谱，比对可以发现，3者在488 nm附近有共有吸收峰，且样品中加入葡萄糖后吸收光度变化明显。因此，本试验采用488 nm为总多糖定量波长。葡萄糖标准品吸光度与浓度的回归方程为y=0.0079x+0.027，相关系数R2=0.9995，线性关系良好。方法学考察精密度、重现性和稳定性，结果表明，RSD分别为0.2%、0.31%和1.3%，表明该方法稳定、可靠。采集样品紫外光谱，记录488 nm处吸光度值，结合葡萄糖标准品回归方程计算12个月份铁皮石斛中总多糖含量见表1。结果显示所有样品中，1～5月和12月样品含量较高，平均含量均大于0.28 g/g，含量值高的月份正好与传统采收期吻合，这与李彩霞等[23]对铁皮石斛中多糖含量的积累研究结论相符。5月份以后多糖含量逐渐下降，可能是因为铁皮石斛属于有性繁殖，其开花结实过程消耗了多糖[24]，笔者从前期所做工作中推测可能存在多糖消耗转化为黄酮的代谢途径。总多糖含量变化趋势为先升高后降低；同时，5月份多糖含量的标准差数值最大，亦表示此时期为铁皮石斛生长周期中的剧烈时期，个体差异最大；6～8月含量最低。与铁皮石斛开花结籽时间相符。

2.3 偏最小二乘回归对总多糖含量预测与结果分析

预处理铁皮石斛红外光谱数据设为X变量，总多糖含量数据设为Y变量，利用偏最小二乘回归算法建立总多糖含量的回归预测模型。随机选取训练集∶预测集=2∶1训练集数据用于总多糖含量预测模型的建立，预测集数据对模型预测能力进行验证。

在预处理的基础上，对光谱数据进行一阶与二阶导数处理，Savitsky-Golay平滑5点(SG5)、9点(SG9)、15点(SG15)。红外光谱数据作为X变量，铁皮石斛中总粗多糖含量作为Y变量，正交信号校正(OSC)去除X变量中与Y变量相关性较低的数据，SG平滑可以有效平滑高频噪音，提高信噪比；一阶导数和二阶导数分别用于消除光谱中基线的平移和漂移(散射)可有效消除其他背景的干扰，分辨重叠峰提高分辨率和灵敏度；SNV和MSC用于消除由样品颗粒分布不均匀、颗粒大小不同产生的散射对其光谱的影响[11,25-26]。不同处理模型，训练集模型内部预测能力以参数Rcal2、RMSEE衡量，Rcal2越接近1，RMSEE越小表示模型拟合能力越佳。预测集数据用于对模型预测能力进行外部验证，以参数Rpre2、预测均方根误差(Root mean square error of prediction,RMSEP)衡量，Rpre2越接近1，RMSEP越小表示模型预测效果越佳；15种模型结果见表2。结果显示，15种模型中2D+OSC+MSC+SNV+SG5(图3)模型预测效果较好，RMSEP均小于3.6，预测值与检测值接近。

表1 铁皮石斛1～12月总多糖含量

表2 不同模型的参数和结果

图2 2D+OSC+MSC+SNV+SG5-PLSR模型的训练集拟合结果

图3 2D+OSC+MSC+SNV+SG5-PLSR模型的预测集拟合结果

3 结论

傅里叶变换红外光谱结合化学计量学能快速预测铁皮石斛中总多糖，为市售铁皮石斛质量控制提供了一种快速方法。样品原始光谱经自动基线校正、平滑、纵坐标归一化后用2D+OSC+MSC+SNV+SG5建立的偏最小二乘模型的Rpre2大于0.782，RMSEP小于3.56能够较好地预测铁皮石斛中总多糖的含量。总多糖测量值反映总多糖含量随时间的累积先上升后降低，最高值与铁皮石斛采收时间相吻合。从图2和图3中可以看出：偏离的拟合曲线方程的38、40、41号样品分别隶属4和5月份，排除人为和仪器误差外，测量值偏离预测值，表示该月份样品差异较大，生长波动激烈，从侧面表现了该组样品的标准差较大。由于试验材料的限制，仅采集了云南省玉溪市的铁皮石斛样品，不同生长环境条件下铁皮石斛中总多糖的变化趋势是否能与之相同有待进一步验证。

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