应用RACE法克隆雷竹笋PAL基因及序列分析

张规富,汪 浩

(湖北科技学院 核技术与化学生物学院，湖北 咸宁 437100)

雷竹(Phyllostachyspraecoxf.prevernalis)属禾本科刚竹属,原产于浙江临安一带；鲜雷竹笋富含营养成分,是颇受欢迎的绿色保健食品[1]。雷竹笋被挖取后骤然离体,体内会产生一系列的生理生化变化,导致迅速老化而丧失鲜嫩可口的食用品质,主要表现为纤维素和木质素含量增加,使笋体变硬,含水量降低,营养成分减少[2]。这种木质化过程是在一系列酶促反应下进行的,其中苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase, PAL;EC4.3.1.5)起着重要的作用；PAL是苯丙烷途径的限速酶,它的活性与木质素芳香醇的产量密切相关,直接影响木质素的合成[3]。

目前,一些研究者已对拟南芥[4]、烟草[5]、番茄[6]、葡萄[7]、银杏[8]、香蕉[9]、毛竹[10]、桂花[11]、夏枯草[12]等多种植物的PAL基因进行了cDNA克隆、序列分析以及蛋白质的功能研究,但有关雷竹笋PAL基因的研究尚未见报道。本研究采用RT-PCR及RACE方法克隆了鲜雷竹笋的PAL基因并对其进行了生物信息学分析,旨在为采后雷竹笋的保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

雷竹笋由湖北瑞发生物工程股份有限公司提供。去除笋叶，先用流水冲洗,后用双蒸水冲洗4～5 min,在75%乙醇中浸泡30 s,取出用双蒸水冲洗4次,将笋体表面残存的水分用灭菌滤纸吸干后置于液氮中快速冷却,放置于-80 ℃冰箱中备用。菌株为实验室自备。pMD®18-T Simple Vectorkit购自美国Invitrogen公司。多糖多酚类植物RNA提取试剂盒、Version 2.0 5′ RACE试剂盒、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Mannual试剂盒、胶回收试剂盒均购自武汉泰晟生物有限公司。引物合成及序列测定由武汉转导生物实验室和上海生工公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 参照NCBI上已发表的禾本科PAL基因家族的保守区序列,采用简并引物设计方法设计PCR引物。根据引物试剂盒及扩增序列的要求,利用Prime 5.0软件设计RACE引物(表1)。上述引物均由武汉转导生物实验室合成。

表1 设计的PCR引物

1.2.2 总RNA的提取 鲜雷竹笋的总RNA的提取参照杨卫东等[13]的方法。用无菌DEPC水溶解提取的总RNA,RNA的完整性用琼脂糖凝胶电泳进行检测,通过OD260/OD280来确定RNA的纯度,于-80 ℃的冰箱中保存备用。

1.2.3 中间片段的钓取 以雷竹笋近缘物种的保守序列设计引物PALF4、PALR4,然后进行扩增，钓取中间片段。

1.2.4PAL基因的5′RACE 5′RACEPAL基因的5′端序列采用Invitrogen公司的Version 2.0 5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒获得。对雷竹笋总RNA进行PAL基因第一链cDNA的合成使用Superscript II RT酶和引物GSP-1。对合成的cDNA进行去RNA处理使用RNase Mix。对经RNase处理过的cDNA进行纯化使用DNA纯化系统GLASSMAX DNA isolation spin cartridges。对纯化后的cDNA末端加上多聚C使用dCTP和TdT酶。对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增使用试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP和引物GSP-2,扩增程序为:预变性94 ℃ 1～2 min，变性94 ℃ 0.5～1 min，引物退火55 ℃ 0.5～1 min，引物延伸72 ℃ 1～2 min,共30～35个循环;72 ℃最后延伸5～7 min,5 ℃搁置,直到样品被移出。稀释5 μL第1轮PCR扩增产物到495 μL TE缓冲液中，巢式PCR第二轮扩增使用试剂盒里面的桥连通用扩增引物AUAP和引物GSP-3,扩增程序为:预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 45 s,引物退火55 ℃ 45 s,引物延伸72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃延伸5 min。第二轮PCR产物电泳后,切胶回收纯化目的条带。将纯化后的PCR产物与pMD18T连接,送上海生工公司，对转化后的阳性克隆进行测序。

1.2.5PAL基因的3′RACE 3′RACEPAL基因的3′端序列采用Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒获得。对雷竹笋总RNA进行逆转录合成cDNA使用引物3′CDS primer A和逆转录酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase。以该cDNA为模板,使用引物3′905-1和UPM(Universal Primer A Mix)进行第一轮PCR扩增,扩增程序与1.2.4第一轮相同。稀释第一轮PCR扩增产物50倍,用引物UPM和3′905-2进行第二轮扩增,扩增程序与1.2.4第二轮相同。将第二轮PCR产物进行电泳,切胶回收纯化目的条带。将纯化后的PCR产物送上海生工测序。

1.2.6PAL基因的全长拼接及序列分析 对5′RACE和3′RACE序列测序结果使用DNAman软件进行拼接,全长序列理化分析使用DNAstar软件,PAL基因核苷酸及其编码的氨基酸同源性分析、氨基酸进化树的构建使用MegAlign软件。

2 结果与分析

2.1 雷竹笋总RNA的提取

用多糖多酚类植物RNA提取试剂盒抽提鲜雷竹笋的总RNA,所提取总RNA的质量用紫外分光光度计进行检测,OD260/OD280=2.07,表明所提取的总RNA的质量达标;对所提取的RNA用琼脂糖凝胶电泳进行检测,可见两条清晰的条带,无明显拖带(图1),表明该总RNA无降解,可用于后续研究。

图1 雷竹笋RNA的电泳鉴定结果

2.2 雷竹笋PAL基因中间片段的钓取

以设计的引物PALF4、PALR4扩增钓取雷竹笋PAL基因的中间片段,产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析,得到1条长603 bp的特异性扩增条带(图2),其中有效的中间片段长503 bp。

1:中间片段PCR产物; M: Marker相对分子质量标准。

2.3 雷竹笋PAL基因的5′RACE

用从笋尖组织提取的总RNA为模板,经过两轮PCR扩增,采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析,检测到1条特异扩增条带,大小为250～500 bp(图3)。将纯化后的PCR产物与pMD18T连接,对转化后的阳性克隆进行测序,大小为463 bp；5′RACE末端附近由于加接头的实验特殊性,导致100多个碱基可能不准确,正确的编码区序列长305 bp。

1：5′PAL基因PCR产物; M： Marker相对分子质量标准。

2.4 雷竹笋PAL基因的3′RACE

对雷竹笋总RNA进行逆转录合成的cDNA,经过两轮PCR扩增,产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析,检测到1条特异扩增条带,大小为1000～2000 bp(图4)。将纯化后的PCR产物送至上海生工公司直接测序,得到碱基序列含1445 bp,拼接时有效的碱基序列含1397 bp。

2.5 雷竹笋PAL基因的序列分析

雷竹笋PAL基因5′RACE、中间片段和3′RACE碱基序列通过DNAman软件拼接,得到2511 bp的全长cDNA序列,核苷酸序列的94～2196 bp区域为开放阅读框,总长2103 bp。PAL基因共编码701个氨基酸的多肽(图5)。

1：3′PAL基因PCR产物; M：Marker相对分子质量标准。

从图5可以看出,在701个氨基酸中,强酸性氨基酸(D,E)78个,强碱性氨基酸(K,R)73个,疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V,M,P)310个,极性氨基酸(G,S,Y,C,T,N,Q,K,R,H,D,E)391个。总体上,PAL蛋白中极性氨基酸的数目较多,可以推断,PAL蛋白属于亲水性蛋白。

使用DNAStar软件进行分析,PAL基因序列分析结果见表2。从表2可知,预测PAL蛋白分子质量为75.624 kD,预测蛋白质等电点为6.41。在2103个碱基中:A占14.58%,C占29.39%,G占36.47%,T占19.56%,(A+T)占34.14%,(C+G)占65.86%。

表2 雷竹笋PAL基因序列分析结果

2.6 雷竹PAL蛋白二级结构分析

采用SOPMA工具分析二级结构在雷竹PAL蛋白中的比例,结果如表3所示。由表3可以看出,雷竹PAL蛋白的二级结构具有丰富的α螺旋和螺旋卷曲,而β折叠片层结构和β转角结构所占比例较低。

表3 PAL蛋白二级结构所占比例

2.7 雷竹PAL蛋白质三级结构预测

利用SWISS-MODEL同源建模的方法分析和预测得到PAL蛋白的三维结构模型(图6)。从图6可见：雷竹PAL蛋白三维结构模型的模板为1w27.1.A,两者序列的同一性达到70.75%,说明两者的三维结构基本相同；GMQE值(全球性模型质量估测值)为0.85,说明建模质量较好；QMEAN4为2.95，小于4,说明综合计分的质量估计较好；PAL蛋白的三维结构模型为一个带柄的圆锥形。

图5 雷竹PAL基因编码区核酸序列和由此推导的氨基酸序列

2.8 雷竹PAL基因核苷酸序列比较与系统进化树分析

使用MEGA 5.03软件将雷竹PAL基因的核苷酸序列与NCBI中31种已经发表的植物核苷酸序列进行距离和系统进化分析，结果(图7)显示：雷竹PAL与禾本科竹亚科植物毛竹(Phyllostachysedulis)、绿竹(Bambusaoldhamii)的亲缘关系最近;与禾本科植物小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)、佛肚竹(Bambusaventricosa)的亲缘关系较近;与玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)的亲缘关系较远。

左图中红色部分为α螺旋；黄色部分为β折叠片；蓝色和绿色部分为螺旋卷曲。

图7 雷竹PAL基因核苷酸序列的进化树分析结果

3 讨论

在高等植物中PAL基因广泛存在,是木质素合成的关键酶和限速酶[14]。PAL基因的编码区长度变化不大,一般在2100 bp左右[15]。本研究从鲜雷竹笋中分离得到的PAL基因所含的cDNA的开放阅读框长度为2103 bp,编码701个氨基酸；而与雷竹笋同科的高节竹、龙鳞竹、白哺鸡竹、丽水苦竹这4种竹种PAL基因的编码区长均为2136 bp,编码712个氨基酸[16]。说明即使是同科的植物种类,PAL基因也可能存在个性差异。大多数植物PAL基因唯一的内含子位置是保守的,且长度变化很大[15]。5种竹子均具有一个保守的PAL活性位点Ala-Ser-Gly(A-S-G)(图5中雷竹氨基酸序列549-550-551),说明同科植物PAL基因的内含子长度变化甚微。PAL基因的表达在植物中具有组织特异性,且不同家族成员的同一物种PAL基因的表达也不同[10],因此,PAL同源基因在雷竹笋中是否存在还有待应用Southern杂交等方法进行进一步分析。本研究已完成了PAL蛋白二级结构分析以及三级结构的预测,下一步计划通过改变PAL蛋白的结构来探讨PAL基因对雷竹笋生理生化的影响,从而进一步构建RNA干扰表达载体转至雷竹笋中,探究PAL基因在雷竹木质素合成过程中的作用机制。

4 小结

本研究成功地从鲜雷竹笋中分离得到了一个全长PAL基因,其开放阅读框长度为2103 bp,共编码701个氨基酸,含1个保守的活性位点Ala-Ser-Gly(A-S-G)；预测PAL蛋白质分子质量为75.624 kD,等电点为6.41；在2103个碱基中，A占14.58%,C占29.39%,G占36.47%,T占19.56%,(A+T)占34.14%,(C+G)占65.86%；在PAL蛋白的二级结构中含有大量的α螺旋和β折叠；其三级结构模型为一个带柄的圆锥形。

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