MiRNA与NSCLC关系的研究进展

朱 莉,郭 佳,谭 平

(吉林大学中日联谊医院 呼吸科，吉林 长春130033)

肺癌是人类最常见的死亡原因之一[1]，非小细胞肺癌(NSCLC)是最普遍的肺癌类型，占总体肺癌病例的80%-85%，因早期特异性临床症状较少，NSCLC患者临床确诊时常已进展至肿瘤晚期阶段，此阶段多数患者治疗效果有限，5年生存率约14%。微小RNA(miRNA)是一种小的非编码单链RNA，可在转录后水平对基因表达进行调控，具体调控机制为结合靶mRNA的3'-UTR(3'-非编码区域)[2]，在肺癌的诊断、治疗及其耐药性发生等多个过程中发挥重要的作用，通过深入研究miRNA与肺癌关系，有望提高未来肺癌诊断的灵敏度和特异性[3，4]。

1 miRNA的生物过程及功能

miRNA是一种内源性单链非编码的小RNA分子，由19-22个核苷酸组，可通过对mRNA转录后水平识别和影响，进而产生基因调节、动植物细胞基因表达调节等作用[5，6]，并可调控50%以上的人类蛋白编码基因[7]。miRNA的前体为大约70个核苷酸(nt)大小的RNA分子，可形成发夹结构，此前体在多种酶(RNA聚合酶II、RNaseIII家族中的Drosha、Dicer等)的作用下逐步产生初级前体(可大于1kb的长片段)、发卡状前体(pre-miRNA，长约65nt)、及长约22nt的双链RNA[8]。双链RNA中的一条链被降解，而另一条链则转化为成熟的miRNA。成熟的miRNA主要通过与靶基因3’端UTR碱基配对(完全或不完全)，而对细胞的生物学功能发挥控制作用[9-11]。根据miRNA的功能可将其大致分为两类，一些miRNA具有促癌基因的特性，其高表达可促进肿瘤的发生发展，另一些miRNA具有抑癌基因的特性，抑制其表达会促进肿瘤的发生[12]。Let-7是一种抑癌基因，它可通过抑制致癌基因、调控有丝分裂相关基因(如：RAS，MYC，HMGA2等)发挥作用[13]，同时有助于对腺癌(adenocarcinoma，AD)和鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)进行病理分型[14]。

2 miRNA与NSCLC的诊断

miRNA可为NSCLC患者提供无创性诊断方法。经过福尔马林固定和石蜡包埋之后的标本中依然可以有效地提取和评估miRNA[15]，除病变组织外，miRNA也存在于人体各种体液中，包括血清、血浆、唾液、尿液、乳汁、脑脊液及精液[16-18]，有学者已在NSCLC患者的支气管肺泡灌洗液[19,20]、胸腔积液[21,22]及血液/血浆/血清[7，18，23]中找到了肿瘤相关的miRNA，推动了以细胞外核酸为基础的新型非侵入性检查方法的发展。

2012年，Roa等人[24]选取痰液中5种miRNA(miR-21，miR-143，miR-155，miR-210，miR-372)进行层序聚类分析发现这5种miRNA可用于检测NSCLC患者(83.3%敏感性和100%特异性)，2015年，Kim等人[25]再次验证这5种miRNA表达水平在NSCLC患者与健康对照者痰样品之间存在差异(100%敏感性和83.3%特异性)。2016年，Razzak等[26]对NSCLC患者痰液检测发现，mir-21，mir-210和mir-372可用于NSCLC患者早期诊断(67%敏感性和90%特异性)，其对晚期NSCLC患者也可发挥重要诊断价值(敏感性和特异性64%和100%)；2010年，研究者[27]通过收集早期肺腺癌患者的痰液进行分析发现，miR-21，miR-486，miR-375和miR-200b在早期肺腺癌患者痰液中高表达，联合上述4种痰液miRNA可达到早期肺腺癌检测最佳预测值(80.6%敏感性，91.7%特异性)；miR-21不仅在NSCLC患者痰液中高表达，其在外周血中也有明显升高，提检外周血 miR-21可用于NSCLC诊断(78.80%敏感性，100.00%特异性)[28]。除miR-21外，NSCLC患者的外周血中存在多种异常表达的miRNA，Yang等[29]发现外周血单核细胞中miR-10b的表达水平可以区分NSCLC患者和非肿瘤患者，ROC曲线分析估计miRNA-10b的峰值诊断灵敏度为86.5%，特异性为76.9%。Lv等[30]发现miR-146a，miR-222和miR-223在Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌患者血清中显着表达，可用于肺腺癌的早期诊断；Tian F等[31]通过18对配对血清和18对配对组织样品miRNA测序发现,在这些配对的样品中，miR-181b-5p在鳞状细胞癌(SCC)中上调，在腺癌(AC)中miR-486-5p下调。NSCLC患者的支气管肺泡灌洗液中也可发现异常表达的miRNA，Schmidt B等[19]发现，hsa-miR1285、1303、29a-5p及650在支气管肺泡灌洗样本中有高表达。

miRNA从细胞内释放到体液的机制包括细胞死亡(坏死和凋亡)和活动性分泌[20]。生化分析显示存在于血液中的细胞外miRNA对RNA酶具有抵抗性，对PH值及温度的变化也表现出稳定性[16，17]，这和miRNA选择性包装(如外分泌体)、与RNA结合蛋白(如AGO、磷酸蛋白NPM1)或核糖体蛋白结合有关[21]。研究显示[22]，NSCLC患者外泌体miR-21，外泌体miR-21与肿瘤大小和肿瘤-淋巴结转移(TNM)阶段显着相关(P<0.05)，高外泌miR-21患者的无病生存率 DFS)明显低于低外泌miR-21患者(P<0.05)。Rabinowits等[32]通过对比肺腺癌患者与非肺癌患者循环外分泌体miRNA水平发现，外分泌体的miRNA特征与原始肿瘤细胞miRNA的表达扩增相平行。肿瘤细胞来源的外分泌体具有促进肿瘤作用并可促进癌症刺激活动如增殖、细胞外基质重塑、迁移、侵袭、血管生成和转移等[33]。其表达水平及扩增的变化可作为诊断标志物用于早期发现肿瘤、确定肿瘤类型。

3 miRNA与NSCLC的靶向治疗

近20年有大量学者致力于研究与肺癌靶向治疗有关的基因突变，目前研究较为透彻的包括表皮生长因子受体(EGFR)外显子19(ex19del)和外显子21(L858R)突变，二者约占所有NSCLC患者EGFR突变的90%，此外还有棘皮动物微管相关蛋白样4(EML-4)-间变性淋巴瘤激酶(ALK)重排[34,35]。 EGFR突变和ALK重排联合应用可以检测到多达20%的晚期非小细胞肺癌。重要的是，选择性酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已被开发用于治疗含有这些靶向基因改变的NSCLCs，例如以EGFR酪氨酸激酶结构域为靶标的吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼，抑制ALK融合蛋白的酪氨酸激酶结构域的克唑替尼[36,37]。对于具有EGFR突变及ALK阳性的NSCLC患者，EGFR、ALK-TKIs可延长其无进展生存期并提高以铂类为基础有研究证实，对于具有EGFR突变的晚期NSCLC患者，EGFR-TKIs的治疗效果优于传统化疗方案[38]。EGFR-TKIs已经取得了巨大的成功，并成为NSCLC标准治疗方案之一[39]。NSCLC肿瘤细胞对EGFR-TKIs的反应与循环miRNA密切相关，约有20-44%患者对EGFR-TKIs产生获得性耐药，其机制为肿瘤细胞EMT(上皮-间充质转化)表型变化引起表观遗传调控的改变[40，41]。miR-134，miR-487b和miR-23a与吉非替尼耐药有关，其机制为TGF-β1以miR-134和miR-487b为中介，通过磷酸化PTEN抑制MAGI2进而诱导EMT形成[42]，同时，TGF-β1可通过激活smad，miR-23a产生E-钙粘蛋白抑制来诱导EMT[43]。沈等[44]研究128例NSCLC(EGFR基因突变者60例，非EGFR基因突变者68例)发现，EGFR基因突变患者血清miR-21、miR-10b表达水平明显增高。单变量和多变量分析显示，抑制miR-21表达可提高吉非替尼治疗NSCLC患者的总体生存率。因此，miR-21表达水平可作为独立性预测因子用于评估EGFR-TKI治疗效果。王等[45]通过实验队列发现，在治疗敏感与治疗耐药患者之间，有153种miRNAs存在差异性表达，之后的验证队列发现，miR-21、miR-27a和miR-218在治疗耐药患者中表达明显增加，这提示miR-21与EGFR-TKIs原发性耐药有关。李等[46]研究显示miR-21参与EGFR-TKIs获得性耐药，在25例接受EGFR-TKI治疗的晚期NSCLC患者中，血清miR-21表达水平在获得性耐药时显著高于基线水平(P<0.01)，经过动物模型验证，miR-21可通过下调PTEN、PDCD4及激活PI3k/Akt通路来引发EGFR-TKI耐药形成。PTEN为肿瘤抑制蛋白，可通过将磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)转化为磷脂酰肌醇4,5-二膦酸(PIP2)负调控PI3K/Akt通路[47]。PTEN基因的丢失或突变存在于许多人类恶性肿瘤疾病中，其发生与Akt激活(PI3k/Akt通路)有关，而Akt激活已被证实在化疗耐药过程中发挥重要作用。

4 总结

现代社会生活节奏加快，多数人面对与日俱增的生活压力倾向选择吸烟缓解，吸烟总人数升高，肺癌的发病率升高，而肺癌诊治方法提高有限，肺癌患者生存率较低，多数患者明确诊断时已处于疾病中晚期阶段，部分患者出现全身转移情况，限制了临床治疗效果，束缚的临床治疗手段，并增加了肺癌死亡率，因此肺癌诊断、治疗方法新突破是当前科研工作面临的重要任务。通过检测肺癌患者的组织、体液发现，miRNA均有表达，且可稳定的存在于外周循环血浆中，这个特点为miRNA成为肺癌早期无创性诊断工具提供了可能性，为科研工作提供了新的突破口。近10年，随着miRNA在肺癌诊断、治疗及预后方面研究的逐渐深入，miRNA检测方法及鉴定技术取得了巨大进步，miRNA作为生物标志物甚至治疗药物被应用于临床实践方面具有大好前景。