鸡毒支原体河南株的分离鉴定及生物学特性研究

徐引弟　焦文强　王治方　李海利　张青娴　朱文豪　王克领

摘要：为确诊2017年4月引起河南省许昌市某蛋鸡场蛋鸡发生呼吸道、关节疾病的病原，采集发生呼吸困难、关节肿大蛋鸡的肺、气管、关节液共21份病料，通过病原分离培养、16S rRNA 基因序列测定比对，确定病原为鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG），共分离鉴定12株鸡毒支原体。对其中分离自肺的毒株HNMga1进行16S rRNA序列分析、动物试验和药敏试验，发现该菌对鸡具有较强毒力，对大观霉素、环丙沙星、左氟沙星、林可霉素、氟苯尼考、乙酰螺旋霉素、克林霉素最为敏感。本研究为下一步研制鸡毒支原体的诊断试剂和筛选疫苗毒株打下基础，同时为鸡毒支原体病的诊断和防治提供了依据。

关键词：鸡毒支原体；分离鉴定；毒力；药敏试验

中图分类号：S858.31 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0124-05

Abstract In order to confirm the cause of respiratory and articular diseases in a laying hen farm in Xuchang City， Henan Province， 21 samples containing lungs， tracheas and joint fluid of laying hens with dyspnea and arthrocele were collected in April 2017. The pathogen was identified as Mycoplasma gallisepticum by pathogen isolation and culture， 16S rRNA gene sequencing and blasting. Twelve strains of Mycoplasma gallisepticum were isolated and identified. The HNMga1 strain isolated from lung was analyzed by 16S rRNA sequence analysis， animal test and drug sensitivity test. The isolate was virulent to hens and most sensitive to spectinomycin， ciprofloxacin， levofloxacin， lincomycin， florfenicol， acetylspiramycin and clindamycin. It would lay a foundation for the further development of diagnostic reagent for Mycoplasma gallisepticum and the screening of vaccine strains， and also provide the bases for the diagnosis and control of Mycoplasma gallisepticum.

Keywords Mycoplasma gallisepticum； Isolation and identification； Virulence； Drug sensitive test

雞毒支原体又称鸡败血支原体，是引起鸡和火鸡等多种禽类慢性呼吸道病（chronic respiratory disease，CRD）或火鸡传染性窦炎的病原，其特征为咳嗽、流鼻涕、呼吸道啰音和张口呼吸。该病原体存在于病鸡和带菌鸡的呼吸道、卵巢、输卵管和精液中，带菌鸡胚可垂直传递给后代，公鸡可通过交配将病传遍全群。鸡群一旦染病即难以彻底根除。雏鸡比成年鸡易感，成年鸡常无明显症状，应激因子及其它呼吸道病原微生物、新城疫弱毒株、大肠杆菌等继发感染或协同作用，使病情恶化、症状明显。发病率与死亡率的高低，除与日龄和菌株有关外，与并发感染、饲养管理、卫生条件以及应激等也有关系。该病发病率一般为30%～40%，高者可达80%以上；死亡率1%～10%，高者可达20%～50%[1-3]。

随着人们长期用药不规范，使得MG对泰乐菌素、替米考星等药物产生可遗传耐药性[4-6]。目前疫苗免疫是预防MG感染的最主要手段，灭活疫苗具有安全、稳定和易保存等优点，解决了MG 感染带来的产蛋率下降问题。然而疫苗使用虽然降低了 MG 排放量从而减轻CRD 症状，但不能抑制 MG 的水平传播。弱毒疫苗是目前用于预防CRD的主流疫苗，具有免疫反应快、用量少等优点[7-10]。鉴于此，本试验从河南省许昌市某蛋鸡场发生鼻窦炎、呼吸困难致死的产蛋鸡肺脏中分离鉴定鸡毒支原体，为鸡慢性呼吸道病的诊断和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源与毒株

2017年4月，河南省许昌市某蛋鸡场蛋鸡发生鼻窦炎、呼吸困难、关节肿大、跛行等症状，具体表现极度消瘦、产蛋下降、翅膀下垂、慢性零星死亡。剖检可见眶下窦充满浆液性、粘液性或干酪样分泌物，气囊浑浊、增厚，关节皮下有纤维素性分泌物。阳性对照毒株F36购自青岛易邦生物工程有限公司。

1.2 主要试剂和培养基

PPLO肉汤粉、胰蛋白大豆琼脂（TSA）、酵母粉、琼脂粉，购自美国BD公司。葡萄糖、酚红，购自上海国药集团公司。改良eagles培养基（MEM）、马血清，购自Hyclone公司。青霉素购自华北制药集团公司。精氨酸购自Roche公司。犊牛血清、2×Taq PCR Mix、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）有限公司。

PPLO液体培养基的制备：PPLO肉汤粉10.5 g，葡萄糖2.5 g，酵母粉2.5 g，溶于440 mL超纯水中，115℃灭菌15 min，加MEM 5 mL、马血清50 mL、8万单位青霉素5 mL、10%精氨酸10 mL和1% 酚红500 μL；PPLO固体培养基的制备：将含1.5% 琼脂粉的PPLO液体培养基（无酚红）于115℃灭菌15 min，于4℃保存备用。

TSA固体培养基的制备：称取40 g TSA溶于1 000 mL水，121℃高压灭菌15 min。温度下降到大约45℃时，加入50 mL犊牛血清，混匀之后倾倒无菌平皿，4℃保存备用。

1.3 鸡毒支原体的分离培养

无菌条件下分别向采集的气管、肺组织、关节分泌物加入2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），碾磨后5 000 r/min离心3 min，上清用0.45 μm滤膜过滤于PPLO液体培养基中，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。3～5 d后，液体培养基变黄即接种固体培养基，未变黄继续传代培养，肉眼观察固体平板上是否有菌落生长，若有则在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落形态，吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态。同时肺、关节组织涂布TSA平板，37℃、5% CO2 培养箱中培养24～36 h。

1.4 鸡毒支原体的鉴定

1.4.1 引物的设计 根据GenBank中鸡毒支原体F株16S rRNA基因（Genbank No.CP001873）设计引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成，上游引物P1： 5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物P2： 5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′，预计扩增目的片段1 483 bp。

1.4.2 PCR鉴定 将疑似支原体菌落接种于PPLO液体培养基，置于37℃、5%CO2 培养箱中培养3～5 d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。PCR反应体系（总体积为25 μL）：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上下游引物P1、P2各1 μL （10 μmol/L），模板DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR循环体系：95℃ 5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。取10 μL扩增产物进行电泳，观察结果。阳性结果进行测序并用Blast比对序列。

1.4.3 16S rRNA基因的序列分析 将分离自肺的鸡毒支原体菌株命名为HNMga1，于2017年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No：13857。用DNA Star软件对HNMga1的16S rRNA基因进行分析并绘制系统进化树。

1.5 动物试验

选45日龄健康鸡20只，均为鸡毒支原体ELISA抗体阴性。试验鸡随机分为两组，对照组和试验组各10只。将HNMga1接种于PPLO液体培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培養3 d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数并计算培养物原液菌体浓度，调整菌体浓度至107 CFU/mL，试验组动物通过喉气管接种1 mL HNMga1，对照组动物通过喉气管接种1 mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为15 d，每天观察试验动物临床表现，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变并采集病料。于15 d试验结束时，剖杀所有试验动物。

1.6 药敏试验

利用药敏纸片法对分离的HNMga1进行药敏感试验，将HNMga1接种于PPLO液体培养3 d后，测定菌体浓度，涂布PPLO固体平板并贴药敏纸片于平板中央，所用药敏试纸种类如下：环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星、加替沙星、林可霉素、氟苯尼考、氯霉素、链霉素、多西环素、四环素、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、大观霉素、乙酰螺旋霉素、克林霉素、阿奇霉素、依诺沙星、克拉霉素、妥布霉素。3 d后根据抑菌圈直径大小判断药物敏感性。

2 结果与分析

2.1 鸡毒支原体的分离培养

气管、肺、关节液碾磨上清过滤后，接种固体培养基5 ～ 10 d，其中1个气管、2个肺、9个关节液上清所涂平板陆续肉眼见极小的圆形、光滑、透明、露珠状菌落。低倍显微镜下观察固体培养基上菌落形态呈圆形，菌落中央有颜色较深且致密的乳头状突起，典型的“煎荷包蛋样”（图1）。吉姆萨染色，油镜下观察菌体为多形态，呈球形、卵圆形、弯曲的丝状、螺旋状（图2）。TSA平板上未有细菌生长。

2.2 鸡毒支原体的鉴定

将12株疑似分离菌进行PCR扩增，结果如图3，引物P1、P2扩增出符合预期大小片段，经测序，与鸡毒支原体ATCC15319 （Genbank No. JN935884）、B3443-15-3-60 （Genbank No. MF196180）、NBRC14859 （Genbank No. NR_113687）、B2 （Genbank No. FJ666137）、PG16 （Genbank No. NR_044638）同源性均在98.5%以上，与鸽支原体FG295 （Genbank No.EU859979）、MMP-1 （Genbank No. NR_025063） 及其它支原体同源性均低于93%。12株分离菌之间序列一致，证明分离的毒株均为同一毒株，即鸡毒支原体。

2.3 16S rRNA基因的序列分析

用DNA Star软件中的MegAlign对HNMga1的16S rRNA 基因的核苷酸序列进行系统进化树分析，如图4，鸡毒支原体16S rRNA 基因分成3个群，HNMga1的16S rRNA 基因与ATCC15319、B2、B293-15-7-347、B3443-15-3-60、B878-14-M3、B878-14-M2_131、NBRC14859、PG16同源性最近，在同一个群，与A5969、NBRC14855、ABAB1999、ATCC19610、MG-V25-2、PG31、R、S6同源性稍远，而与疫苗株F同源性较远，F株单独在一群。

2.4 动物试验结果

试验组动物在接种支原体5 d后陆续表现出不同程度的临床症状：精神不振、流涕、咳嗽、喘气、张口呼吸、头部肿胀，7 d后死亡1只，10 d后死亡2只。发病率100%，死亡率30%。对照组动物在试验期间无临床症状。试验结束后剖杀试验组和对照组动物，采集病料，进行支原体分离。试验组出现不同程度的鼻窦炎、气囊炎，眶下窦充满灰白色浆液性、粘性分泌物，气囊不同程度混浊。对照组剖检均未发生明显病理变化，且病料均未分离到支原体，试验组的10份病料中均分离到鸡毒支原体，菌落形态、PCR鉴定结果与HNMga1一致。

2.5 药敏试验

由表1可知，HNMga1对大观霉素、环丙沙星、左氟沙星、林可霉素、氟苯尼考、乙酰螺旋霉素、克林霉素最敏感，其次为四环素、诺氟沙星、氯霉素、加替沙星，对阿奇霉素、链霉素、妥布霉素、依诺沙星、多西环素、罗红霉素、红霉素、复方新诺明、克拉霉素表现耐药。

3 讨论与结论

本试验从发生呼吸困难、关节肿胀蛋鸡的肺、气管、关节中经过固体培养、镜检染色、PCR鉴定，分离出12株鸡毒支原体菌株，对分离自肺的毒株HNMga1进行16S rRNA基因序列分析、动物试验和药敏试验，为下一步研制鸡毒支原体诊断试剂和筛选疫苗毒株打下基础，同时为慢性呼吸道病的诊断和防治提供依据。

MG近年来对世界各国的养禽业造成了巨大的经济损失，1933年Nelson[11]首次从感染鸡群中分离出该病原体，随后广泛迅速传播，成世界性流行病。1976年哈尔滨兽医研究所从患有慢性呼吸道病鸡群中分离到MG，随后1984年毕丁仁等[12]首次从北京和南京分离到61株支原体，之后在全国迅速传播。我国鸡群MG阳性感染率已达50% ～ 80%[13-17]。MG的传播主要经过水平和垂直传播，造成MG代代相传、疾病不断流行，难以根除。疫苗免疫是防治MG的主要措施，主要有灭活苗和弱毒苗，灭活苗可产生较好的免疫力，但需时长、接种剂量大、接种次数多，不能通过滴鼻点眼方式刺激粘膜免疫；弱毒苗可以快速刺激机体产生粘膜免疫，但是受母源抗体干扰，存在散毒风险[7-10]。因此，任何一种疫苗都无法提供完全的免疫。抗生素药物包括大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类等，对MG都有一定的疗效，但效果不理想。MG存在于纤毛尖部，药物难以到达，使得支原体难以根除，长期使用，造成药物残留，极易产生耐药性[18-26]。

本试验中蛋鸡场长期受MG的困扰，蛋鸡呼吸困难、生长缓慢、产蛋率下降、零星死亡，尽管使用疫苗免疫和药物也不能有效控制MG感染，从气管、肺、关节中仍分离到高毒力MG，尽管体外药敏试验结果显示对部分药物敏感，但临床使用效果不理想，因此MG的防控不仅需要疫苗防疫和药物治疗，更需要包括加强生物安全、饲养管理、种鸡、鸡蛋及公鸡的净化等综合措施。

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