水稻细胞色素P450基因OsDWARF48调控株高的功能分析

李臻　王庆国　潘教文　刘炜

摘要：本研究以水稻中花11为材料克隆了一个P450家族基因，命名为OsDWARF48。该基因在水稻中为组成型表达，在幼胚中的表达量最高；并且其表达受到BR的抑制。进一步以获得的基因过表达及反义转基因植株为材料，对株高进行测量，结果显示，OsDWARF48反义转基因株系株高明显矮于对照，而过表达转基因株系OE3株高明显高于对照。通过对水稻内源生长素、油菜素内酯和赤霉素的含量测定，发现3种激素在反义转基因株系中含量均下降，在过表达转基因株系OE3中含量均上升，表明OsDWARF48通过调控BR合成及信号转导途径，进而与GA和IAA协同作用调控水稻株高。

关键词：水稻；细胞色素P450基因OsDWARF48；株高；油菜素内酯

中图分类号：S511.3+2：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0001-09

Abstract In this research， a P450 family gene named as OsDWARF48 was cloned from rice variety Zhonghua 11. OsDWARF48 was constitutively expressed in various rice tissues and the highest expression was found in immature embryos， and its expression could be inhibited by BR. After the rice lines with over- and anti-sense expression of OsDWARF48 were obtained， the plant height was measured. The height of anti-sense transgenic lines was shorter while that of over-sense transgeinic line OE3 was higher compared to the control. The detection of endogenous BR， IAA and GA in different rice lines showed that their contents decreased in anti-sense transgenic lines with shorter height， but increased in the OE3 line with higher height. The results above indicated that OsDWARF48 might control the plant height of rice by regulating the synthesis and signal transduction pathways of BR and further synergy with GA and IAA.

Keywords Rice； Cytochrome P450 gene OsDWARF48； Plant height； BR

株高是水稻株型的主要决定因素，同时也是重要的农艺性状，直接关系到水稻的收获指数和增产潜力，过高易引起茎秆的倒伏造成减产。20世纪50年代研究者们发现水稻半矮秆基因sd1并进行广泛应用，其通过降低株高使水稻单产提高20%～30%，被称为“第一次绿色革命”，如今仍作为株高重要的调控基因被应用于育种中[1]。但是携带sd1的材料具有抗旱性差、光合效率低等缺点，也成为制约水稻新品种选育的瓶颈[2]。因此继续挖掘水稻矮化新品种，开展株高相关基因定位及功能研究，对水稻育种和生产具有重要指导意义。

水稻茎秆的生长发育受多种因素影响，其中植物激素、转录因子、细胞周期、微管及微丝的排列、细胞壁合成、光合产物合成及转运等相关基因都具有重要作用[3-5]。对水稻中调控株高相关基因的功能进行分析，发现其中大多数与赤霉素（gibberellin， GA）、油菜素内酯（brassinolide， BR）及生长素（auxin， IAA）的代谢或信号转导相关：除了直接参与激素合成及信号转导的相关基因，如GA合成及信号传导相关基因d18、d35、OsGA20ox1、OsKS1、SLR1，BR合成及信号传导相关基因D2、d11、brd2、OsBRI1等[6，7]；还有部分基因能够通过调控激素的合成及信号转导影响水稻株高，如NAC转录因子OsNAC2通过调控水稻GA信号通路关键基因OsSEATB和OsKAO的表达，影响GA的积累从而负调控水稻株高[8]；受体激酶LRK1基因下调OsKO2的表达，通过限制GA的合成调控水稻节间伸长[9]。以上研究显示激素在调节水稻株高中起主导作用。

细胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）是一类血红素蛋白，属于单加氧酶超家族，其主要功能是催化有机化合物的氧化还原反应，因其最低能量吸收峰在450 nm处而得名。1958年，Kligenberg 和 Gerfinkel 首次在大鼠肝微粒体中报道了该基因，现已证明其存在于细菌以及动植物的各个组织中[10]。CYP450通过N端的疏水序列锚定在膜上，属于膜定位蛋白，在真核细胞中主要分布在內质网和线粒体内膜上。作为一种末端加氧酶参与包括植物激素、信号分子、黄酮类、甾醇类、萜类等多种初级和次级合成及代谢反应[11，12]，同时在植物响应生物、非生物胁迫[13，14]及植物除草剂抗性[15，16]等方面具有重要作用。水稻中含有47个CYP450家族，其中部分基因的功能获得解析，如DSS1编码细胞色素氧化酶CYP96B4家族成员，通过协调GA和ABA平衡，介导水稻生长以及胁迫应答，同时可能还在脂类代谢中发挥作用[17]；CYP78A13能促进细胞增殖，有增加株高并提高籽粒产量的潜力[18]；过表达CYP71Z2能够持续且稳定提高水稻对白叶枯病菌（Xoo）的抗性，而CYP71Z2-RNAi株系与野生型一致，对Xoo的抗性没有明显差异[19]。截至目前，大部分CYP450的基因功能还没有获得研究。

本课题组前期在水稻黑条矮缩病相关基因数字表达谱的基础上，鉴定到一个表达明显上调的基因，功能注释为CYP450基因， KEGG预测其参与油菜素内酯合成过程。本研究克隆了该基因，并将其命名为OsDWARF48（LOC_Os04g48200），BLAST分析显示，该基因编码蛋白为CYP450家族CYP87A3样蛋白，其表达受油菜素内酯的抑制，推测其可能参与油菜素内酯的合成或代谢过程。其反义及过表达转基因株系中，部分水稻株高发生变化，并与转基因株系内源油菜素内酯含量及相关基因的变化呈一定相关性。本研究结果对于水稻株型改造及品质改良具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水稻中花11种子由本实验室保存。

大肠杆菌DH5ɑ购自Transgen公司（山东济南雨同生物科技有限公司）；农杆菌LBA4404由本实验室保存；克隆载体pMD18-T购自TaKaRa（日本）公司；植物双元表达载体p1301-bar-UBI由山东农业大学温孚江教授惠赠，该载体是以pCAMBIA1301为骨架改造而成，含有除草剂Basta抗性基因bar和单子叶植物Ubiqutin启动子。

1.2 RNA的提取及反转录

按照TransZol Plant 试剂盒（Code： ET101-01，购自Transgen公司）说明书提取水稻组织总RNA，并参照TaKaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A） 试剂盒说明书将检测合格的RNA反转录合成第一链cDNA。

1.3 OsDWARF48基因克隆及生物信息学分析

以反转录的水稻叶片单链cDNA为模板，根据OsDWARF48核苷酸序列（NCBI登陆号：XP_015635235.1），设计并合成特异性引物LDWARF48，进行PCR扩增，引物序列见表1。反应条件为：94℃ 10 min；94℃ 45 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸10 min。将获得的DNA片段连入克隆载体pMD-18T中，经酶切鉴定后，阳性质粒由山东省农业科学院生物技术研究中心测序室进行序列测定。利用水稻基因组注释网站Rice Genome Annotation Project （http：//rice.plantbiology.msu.edu）对OsDWARF48的基因结构及编码蛋白基本信息进行分析。

1.4 OsDWARF48表达模式分析

分别提取生长4周水稻幼苗的叶片、茎秆、根以及花、未成熟胚和成熟种子的总RNA，以反转录产物为模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）为内参，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsDWARF48基因在不同组织器官中的表达模式。

用10 μmol/L油菜素内酯处理生长2周的水稻幼苗，在0、2、6、12 h分别取材提取总RNA，以反转录产物为模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）为内参，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsDWARF48基因对BR的响应模式，所用引物为qACTIN和qDWARF48，引物序列见表1。

1.5 植物表达载体的构建及水稻的遗传转化

选取测序正确且正向连接的克隆载体pMD18T-OsDWARF48-O和反向连接的克隆载体pMD18T-OsDWARF48-R，用PstⅠ和SamⅠ分别双酶切含有目的基因的这两个克隆载体以及植物双元表达载体p1301-bar-UBI，切胶回收目的基因片段和线性化的植物表达载体，经T4 ligase连接，将酶切鉴定正确的阳性重组质粒命名为pCA1301-bar-OsDWARF48-O和pCA1301-bar-OsDWARF48-R。构建成功的植物双元表达载体用热激法转入农杆菌菌株LBA4404中，侵染水稻愈傷组织，用10 mg/L的PPT进行3次抗性筛选，经诱导及分化获得转基因组培苗。

转基因苗在土中生长至6叶期，用浓度为0.2%的Basta溶液涂抹叶片进行抗性筛选。筛选出的阳性苗，提取其叶片DNA，利用LDWARF48上游引物与Nos下游引物组合检测正义过表达转基因阳性植株；利用LDWARF48下游引物与Nos下游引物组合检测反义转基因阳性植株，引物序列见表1。获得确定阳性转基因株系，经多代筛选获得T3代纯合株系。

1.6 株高测定

水稻幼苗株高测定是以水培两周的植株为材料，测定标准为从茎基部到最上面叶片顶端；成熟期水稻株高测定是以生长到抽穗期的水稻为材料，测定标准是从茎基部至穗顶部的长度；每株重复测量3次，取3次平均值为该株的株高，每个株系测量15株。结果用SPSS（23.0）统计软件进行差异显著性分析。

1.7 水稻内源油菜素内酯、生长素、赤霉素含量的测定

取生长两周的对照及转基因水稻叶片材料0.2 g，应用酶联免疫吸附技术（ELISA）分别测定水稻叶片中BR、GA、IAA含量。为减少试验误差，每一个材料取10株混样，并设定3个生物学重复，该试验委托北京北农天一生物技术有限公司完成。结果用SPSS（23.0）统计软件进行差异显著性分析。

1.8 实时荧光定量PCR

根据基因D2、D11、OsBR6ox、OsBRI1、OsBZR1和OsBAK1的全长序列设计实时荧光定量PCR引物，重点对油菜素内脂合成途径中相关基因的表达进行鉴定，基因及引物序列见表1。反应在ABI PRISM 7900 HT（Applied Biosystems）荧光定量PCR仪上进行，反应体系为20 μL，方法参照FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）说明书。反应条件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环。按照2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 基因克隆及生物信息学分析

本研究以水稻品种中花11单链cDNA为模板，利用引物LDWARF48克隆水稻CYP450家族基因OsDWARF48。该基因全长为1 449 bp，含有9个外显子，编码483个氨基酸。生物信息学分析显示：该基因编码蛋白分子量为55.09 kD，等电点为8.47，负电荷残基数（Asp+Glu）52，正电荷残基数（Arg+Lys）55，不稳定系数41.76，是一种不稳定蛋白。该蛋白含有1个P450保守结构域和1个跨膜区，序列前端没有信号肽。与已知功能的水稻（Oryza sativa L.）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的CYP450蛋白进行序列比对显示OsDWARF48编码蛋白含有CYP450的典型基序（图1）。BLAST结果显示，OsDWARF48编码CYP87A3样蛋白，与谷子（Setaria italica）中CYP87A3蛋白序列相似性较高（图2）。

2.2 OsDWARF48在水稻不同组织中的表达模式

以反转录产物为模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）为内参，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析基因OsDWARF48的表达模式。结果显示，OsDWARF48为组成型表达。以该基因在根中的相对表达量为参照，其在幼胚中的表达量相对较高，约是根中的90倍；其次在种子和茎中的表达量也较高，分别是根中表达量的11.22倍及7.73倍；而在花和叶中的表达量相对较低（图3）。

2.3 OsDWARF48诱导表达模式

水稻幼苗经BR处理后，随着处理时间增加，OsDWARF48的表达量逐渐下降，处理2 h的相对表达量为0.84；处理6 h时表达明显下调，为未处理时的29%，随处理时间进一步延长，其相对表达量一直维持在较低水平（图4）。

2.4 转基因株系的获得

转基因组培苗，经继代、Basta（购自日本农药株式会社公司）抗性筛选及PCR鉴定，最终获得2个纯合反义株系（AS1、AS2）和3个过表达转基因株系（OE1、OE2、OE3）。通过荧光定量PCR检测转基因株系中OsDWARF48基因的表达量，结果显示，反义及正义转基因株系幼苗中该基因的表达量都有不同程度的提高（图5），说明基因已经成功转化到水稻品种中花11中。

2.5 水稻株高测定结果

对生长2周的幼苗以及田间灌浆成熟期的水稻株高进行测量，发现在幼苗期反义转基因株系AS1、AS2的株高分别为10.29、10.84 cm，分别为对照株高的73.87%和77.82%；在田间灌浆成熟期AS1、AS2的株高分别为106.88 cm和107.51 cm，分别为对照株高的92.98%和93.54%。统计分析显示在幼苗期和成熟期AS1、AS2株高均与对照相比差异显著，幼苗期差异更加明显。幼苗期过表达转基因株系OE3株高为16.66 cm，为对照的119.60%；田间灌浆成熟期OE3株高为123.6 cm，为对照的107.53%。统计分析显示在幼苗期和成熟期OE3株高均与对照相比差异显著，幼苗期差异更加明显。综上所述，反义转基因株系AS1、AS2的株高低于对照且差异显著，过表达转基因株系OE3株高高于对照也差异显著，而OE1和OE2的株高与对照相比没有明显差异（图6）。

2.6 水稻幼苗内源激素含量

利用ELASA方法测定转基因各株系及对照植株中内源BR、IAA和GA含量。其中BR含量在反义转基因株系AS1、AS2中分别比对照低2.29 ng/gFW和1.61 ng/gFW；在过表达转基因株系中均有升高，且在OE3中比對照高2.22 ng/gFW；统计分析显示AS1、AS2及OE3中的含量与对照相比差异显著。而GA和IAA含量除在OE3中略有升高外，其它株系中含量比对照均有不同程度下降，且含量与对照相比差异显著（图7）。

2.7 不同水稻株系中BR合成或信号转导相关基因的表达变化分析

以对照及转基因水稻株系为材料，应用荧光定量方法对BR合成相关基因D2、D11、OsBR6ox以及信号转导相关基因OsBRI1、OsBZR1、OsBAK1的相对表达量进行分析，结果显示，在过表达转基因株系OE3中，D2、D11、OsBR6ox、OsBRI1、OsBZR1及OsBAK1表达均上调，分别为对照植株的3.01、2.28、2.22、3.22、3.65、1.11倍。转基因株系OE1及OE2中BR合成相关基因OsBR6ox及OsBZR1表达上调，OsBR6ox表达量分别为对照的2.8倍和5.33倍，OsBZR1表达量分别为对照的2倍和1.38倍，其他基因变化不明显。反义转基因株系AS1和AS2中OsBR6ox表达上调，分别为对照的1.86倍和2.53倍；D2、OsBZR1及OsBAK1表达下调，D2表达量为对照的63%和41%，OsBZR1为对照的82%和55%，OsBAK1表达量为对照的59%和50%，其他基因变化不明显（图8）。

3 讨论与结论

水稻株高作为重要的农艺性状之一，其研究一直备受国内外同行关注。水稻黑条矮缩病作为病毒性病害，可导致植株极度矮化、结实率降低甚至不育，严重影响水稻生产。我们在对感病材料进行高通量测序及表达谱分析基础上，筛选到一个表达差异基因OsDWARF48（LOC_Os04g48200），在感病材料中其表达明显上调（Log2Ratio=8.28），KEGG分析将该基因归为油菜素内酯合成途径。

OsDWARF48基因编码蛋白序列分析显示，其含有典型的CYP450保守序列，包括在C末端含有血红素结合区域（FXXGXRXCXG），这个区域在所有CYP450蛋白家族中高度保守并且被作为鉴定CYP450蛋白的主要特征[20，21]；其还有与氧结合和激活相关的PXRX区域以及EXXR区域，这两个区域对于固定血红素和维持蛋白核心结构的稳定性是必须的[22]；其N末端含有一个跨膜区，显示该蛋白为膜结合蛋白，紧邻此区域有一段富含脯氨酸（Pro）的区域，该区域存在于所有典型的CYP450蛋白中[23]。结构分析表明OsDWARF48基因编码典型的CYP450蛋白。同源比对分析显示，OsDWARF48编码蛋白与CYP87A3同源性较高，为CYP87A3样蛋白。

OsDWARF48具有组成型的表达模式，显示该基因在植物生长各阶段，尤其是植物胚的形成及发育中发挥作用。结合OsDWARF48编码蛋白与水稻中参与生长素响应的OsCYP87A3蛋白具有一定的序列同源性[24]，推测OsDWARF48可能通过对植物激素产生响应从而行使功能。BR处理下OsDWARF48的表达受到明显抑制，显示该基因可能受BR的负反馈调节。以往研究表明，许多BR合成相关基因如D2、CYP90C1/D11、OsDWARF4等也受到BR的负反馈调节[25-27]。说明BR在植物体内存在较精细的调控机制，当细胞内BR含量过高时，植物一方面通过代谢途径降解部分BR，另一方面则通过负反馈机制降低BR合成速率，从而达到维系植物体内激素含量动态平衡的目的[28]。

以往报道BR缺失突变体均表现为株高降低，并可通过外施BR得以部分恢复。如OsDWARF4参与水稻BR合成，其突变体株高略矮于对照[27]。OsBR6ox编码BR-6氧化酶，该酶突变后导致茎秆严重矮化，株高只有10～30 cm[29]。D11编码BR生物合成的一个关键酶，其突变会引起植株矮化，而过表达该基因则表现为籽粒变大，产量提高[30]。本研究中，OsDWARF48反义转基因株系株高降低，检测显示OsDWARF48基因表达下调，其内源BR、GA和IAA含量均降低，水稻茎的伸长受到抑制，导致水稻变矮；但过表达株系OE1和OE2的株高并未发生明显变化，对比其内源激素含量发现，OE1和OE2中只有BR含量增加，而GA和IAA含量降低；而在过表达株系OE3中BR、GA和IAA含量均增加，株高也显著高于对照。综合以上结果，显示转基因水稻株高是由BR、IAA和GA协同控制的，BR在其中可能起到主导作用。

BR合成及代谢等过程均对内源BR含量产生影响，而基因的表达变化对相应生物学过程具有重要调控作用。以往报道BZR1在BR、IAA和GA的交互反应中发挥重要作用，BZR1能够与生长素信号转导的调控元件ARF结合，调控其下游多个基因的表达[31]。在拟南芥中的研究证明，BR首先通过抑制GSK3类激酶负调控子部分激活BZR1转录因子的活性从而刺激GA合成，GA水平升高导致另一负调控子DELLA蛋白的降解，从而进一步激活BZR1活性调控基因表达来促进植物生长；在水稻中BR通过调控GA合成和代谢调控细胞伸长，但是具体机制还不清楚[32，33]。

本研究对转基因株系及对照中BR合成及信号转导相关基因的表达分析显示，OsDWARF48过表达水稻中OsBZR1表达上调，而在反义转基因株系中表达略有下降。OsBR6ox在反義和过表达转基因株系中表达均上调，该基因作为BR合成关键基因，调控内源BR的含量，该基因缺失会导致植株严重矮化。推测由于BR合成及代谢相关OsBZR1、OsBR6ox等基因的变化，导致生长素、赤霉素信号途径发生改变，从而引起内源生长素、赤霉素含量变化，对水稻株高产生影响，具体调控机制仍需要进一步解析。

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