西洋梨品种‘红考密斯’的组织培养及离体叶片不定梢再生

孙清荣　关秋竹　孙洪雁

摘要：以西洋梨（Pyrus communis L.）品种‘红考密斯新生长的半木质化嫩枝茎段为外植体，促使腋芽萌发获得无菌试管苗；以试管苗为试材，研究基本培养基、外源植物生长物质对增殖和生根的影响；以试管苗的离体叶片为外植体，研究植物生长物质的种类和浓度对叶片不定梢再生的影响。结果表明，试管苗适宜的增殖培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA；适宜的壮苗培养基为MS+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA；适宜的生根培养基为1/2MS（仅MS大量元素减半）+0.3 mg·L-1 NAA+20 g·L-1蔗糖，生根率为82.2%，平均单株根数为3.3条；叶片不定梢再生的最佳培养基为：NN69+2 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 IBA，不定梢再生率为76.8%，平均每叶不定梢数为1.2个。

关键词：西洋梨；红考密斯；增殖；离体叶片；不定梢再生；生根

中图分类号：S661.204+.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0028-05

Abstract Young semi-lignified branches were selected as explants， and axillary buds were promoted to germinate and to form in vitro shoots. In vitro shoots were selected as materials， the effects of basic medium and external plant growth substance on proliferation and rooting were examined. In vitro leaves were selected as explants， and the effects of the kinds and concentrations of plant growth substances on shoot regeneration were investigated.The results showed that the proper proliferation medium was MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA and the proper medium for healthy shoots was MS+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA. The proper rooting medium was 1/2MS+0.3 mg·L-1 NAA+20 g·L-1 sucrose， the highest rooting rate was 82.2%， and the average root number per plantlet was 3.3. The optimal shoot regeneration medium was NN69+2 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 IBA， the shoot regeneration frequency was 76.8%， and the average shoot number per leaf was 1.2.

Keywords Pyrus communis； Red Comice； Proliferation； In vitro leaf explants； Shoot regeneration； Rooting

梨果营养丰富，深受消费者喜爱。过去人们习惯食用肉质细脆、香甜爽口的东方梨，但随着生活水平的提高，人们对梨果的消费习惯日趋多样化，肉质柔软、香甜溶口、果心小的西洋梨也越来越受消费者喜欢。‘红考密斯梨是由山东省果树研究所从美国引进的一个优良红色西洋梨品种[1]。该品种是‘考密斯的一个浓红型芽变，果皮全红，果肉乳白色，后熟后汁液多，甜芳香味浓，是西洋梨中鲜食品质极佳的品种之一。‘红考密斯梨在我国试栽表现，成熟果实具有鲜红色漂亮外观，而且具有石细胞少、汁液多、香味浓郁等果实品质，受到消费者青睐，市场售价较高，销售形势很好。但除与东方梨一样易受各种病虫害威胁从而导致产量下降、品质受损甚至树体死亡外，西洋梨还抗寒性差且不耐高温，影响其商业化生产，虽然20世纪90年代就已引入，但目前我国的种植规模有限，仍有较大发展空间。

利用育种手段进行抗性改良是提高作物品种抗逆性的有效方法。传统的抗性改良方法是通过与野生种杂交进行抗性性状和有利性状的转移，但梨树具有高度杂合性和较长童期，导致其抗性杂交育种困难，育种周期长。芽变选种也是果树新品种选育的一种有效方法，但芽变多表现株型或颜色的变异，很难发生抗性突变。通过离体叶片不定梢再生的遗传转化操作可以把抗性基因或目的基因直接转移到无性繁殖的待改良果树品种中，从而提高育种效率。西洋梨组织培养和不定梢再生研究国内外有些报道[2-6]，但较少，且不同品种适宜的组培条件也不同，尚未见国内外有关‘红考密斯品种组织培养及离体叶片不定梢再生的研究。本研究对‘红考密斯试管苗建立和增殖、叶片不定梢再生、试管苗生根的适宜组培条件进行试验和筛选，以建立‘红考密斯梨的组培快繁技术体系，满足建园对优质苗木的需求，同时建立其离体叶片不定梢再生体系，为利用生物技术手段改良这一品种、培育具有自主知识产权的新品种奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山东省果树研究所试验基地种植的‘红考密斯梨结果大树。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌试管苗的建立 5月中旬剪取当年生半木质化新梢，剪掉叶片，把枝条剪成一芽一段的芽段，去掉新梢顶端尚未木质化的幼嫩部分。按孙清荣等[7]報道的外植体消毒流程对芽段外植体进行杀菌消毒，用无菌水冲洗5次，置无菌滤纸上吸去表面水分，植入装有腋芽启动培养基的试管内，一管一芽段。腋芽启动培养基为1/2MS（无机盐半量），其余为MS全量，然后加1 mg·L-1 6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、0.4 mg·L-1 吲哚丁酸（IBA）及30 g·L-1 蔗糖，调pH值为5.8，灭菌，然后在（25±2）℃、光照强度40 μmol·m-2·s-1 、光照周期16 h·d-1 条件下培养。

1.2.2 试管苗的增殖 将腋芽萌发获得的无菌试管苗转移到增殖培养基进行继代增殖培养。设4种增殖培养基处理：（1）MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 IBA；（2）MS+0.1 mg·L-1 TDZ（噻苯隆）+0.3 mg·L-1 IBA；（3）MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 TDZ+0.3 mg·L-1 IBA；（4）MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT（6-糠基氨基嘌呤）+0.3 mg·L-1 IBA。每处理接种3瓶，每瓶接种5个外植体，每一继代周期为4周，继代培养3次，观察生长表现并记录每个周期的增殖梢数，以3次继代增殖梢数的平均值作为一个继代周期的增殖倍数。

1.2.3 叶片不定梢再生 挑选增殖培养基上生长健壮的绿苗，切取其顶端展开的幼嫩叶片，用无菌刀片垂直于叶片中脉横切3～5个伤口（依据叶片大小且方便操作）。将切伤后的叶片接种于不定梢诱导培养基上。不定梢诱导培养基以NN69为基本培养基，均添加0.3 mg·L-1 IBA和30 g·L-1 蔗糖，并分别添加细胞分裂素物质6-BA（2 mg·L-1 和4 mg·L-1 ）和TDZ（1 mg·L-1 和2 mg·L-1 ），共构成4个处理。每个处理接种3瓶，每瓶接种10个叶片，重复2次。叶片接种后放完全黑暗条件下连续培养4周，然后转到光照周期为16 h·d-1 条件下培养。诱导培养6周时，观察记录每个处理产生不定梢的叶片数，计算叶片不定梢再生率。叶片不定梢再生率=产生不定梢叶片数/接种总叶片数×100%。

1.2.4 试管苗生根 将腋芽萌发和叶片再生不定梢获得的绿苗在4号壮苗培养基上培养，选取生长到1.5 cm以上的健壮绿梢转移到生根培养基诱导生根。生根培养基以1/4MS无机盐或1/2 MS无机盐为基本培养基，分别添加0.3 mg·L-1 或0.5 mg·L-1 NAA，共构成4 种处理，各处理均加20 g·L-1 蔗糖。每个处理接种5瓶，每瓶种植10个梢，重复2次。接种后放暗培养条件下培养3 d，然后转到光照周期为16 h·d-1 条件下培养4周，统计生根梢数并计算生根率和平均每株根数。

1.3 统计分析

所得数据用DPS v3.01软件统计分析，采用Tukey法进行差异比较。

2 结果与分析

2.1 试管苗的建立和增殖

芽段接种2周即可观察到腋芽萌发（图1A），接种4周，腋芽生长成为无菌小梢（图1B）。将小梢转移到增殖培养基上继代增殖，结果发现在同时加6-BA和TDZ的3号增殖培养基上既有较好的增殖生长又有良好的伸长生长，且梢顶端有较伸展的叶片（图1D），为最适宜的增殖培养基。单加6-BA的1号培养基，虽然伸长生长较好，但伸长茎的中段为基本看不到叶片的光秃部分，且梢顶端叶窄小不伸展并有顶梢枯死现象（图1 C）。单加TDZ的2号培養基，伸长生长良好，叶片大而伸展，但表现不增殖（图1E）。同时加6-BA和KT的4号培养基，伸长生长良好，但梢上半部分呈棒状，叶窄小，伴有顶梢枯死现象（图1 F）。

综合比较‘红考密斯梨在4种增殖培养基上的生长表现，细胞分裂素物质6-BA和TDZ并用的继代增殖效果最佳，表现为既有良好的增殖生长又有良好的伸长生长；6-BA或TDZ单独使用或6-BA和KT并用都不是最佳增殖培养基。但当用于叶片培养取叶或壮苗生根诱导取苗为目的时，单加 TDZ是壮苗和叶片培养的最适宜继代培养基（表1）。

2.2 叶片不定梢诱导

细胞分裂素物质6-BA比TDZ更有利于提高‘红考密斯叶片不定梢再生率，添加6-BA的再生率显著高于添加TDZ的，且不依赖于6-BA和TDZ的浓度（表2）。

各处理的单位叶片不定梢数都表现较低，虽然添加TDZ的略高于添加6-BA的，但平均每叶梢数都低于2个。表明在试验培养基上，‘红考密斯梨叶片虽然可以获得较高的不定梢再生率，但每叶只能产生1～2个不定梢。

在添加6-BA或TDZ的培养基上诱导产生的不定芽，在不定芽诱导培养基上可直接形成节间伸长生长的不定梢（图2A和B），但添加6-BA形成的不定梢叶伸展，苗较高较壮（图2A），而添加TDZ形成的不定梢叶不伸展，梢较矮较弱（图2B）。表明6-BA比TDZ更适宜于诱导产生较壮的不定梢。

综合以上分析，‘红考密斯梨离体叶片不定梢再生的最适宜诱导培养基为NN69+0.3 mg·L-1 IBA+2 mg·L-1 6-BA。

2.3 试管苗生根

2.3.1 培养基组成对试管苗生根的影响 基本培养基的无机盐浓度显著影响生根率和平均每株生根数；相同无机盐浓度下，NAA不同添加浓度对生根率和平均每株生根数无显著影响，以添加0.3 mg·L-1 NAA的略高（表3）。表明‘红考密斯梨试管苗生根不依赖于NAA的浓度，但受MS基本培养基中无机盐浓度的显著影响，适当的盐浓度更利于根的诱导。

2.3.2 培养基组成对根生长的影响 培养基中无机盐浓度较高（图2E和F）比较低（图2C和D）时茎基部产生更多的愈伤，但过多的愈伤不利于移栽成活，因此用于生根移栽时，推荐用较低浓度无机盐即1/4MS培养基。1/4MS培养基上虽然生根率较低，但根基部产生的愈伤较少，易于移栽成活。

3 讨论与结论

根据报道，适宜东方梨品种‘金花、‘丰水和‘幸水、‘黄金、‘新梨7号、‘黄冠梨增殖的基本培养基分别为LE、WPM、ASH、AS和MS，添加的细胞分裂素物质都是6-BA，仅6-BA的浓度因品种的不同而不同[8-12]。另有研究表明，6-BA诱导‘丰水和‘幸水获得正常健壮增殖苗，而TDZ诱导产生玻璃化增殖苗[13]。适宜西洋梨品种‘丰产增殖的培养基为加6-BA的MS培养基[5]，而对于‘巴梨（Bartlett）和宝斯克（Beurre Bosc）两品种则表现以基本培养基DKW 和QL的增殖效果优于MS和WPM[3]。本研究中，同时加6-BA和TDZ的MS培养基可较好诱导‘红考密斯梨增殖，但单加TDZ更适宜诱导有良好叶片伸展的壮苗。

本研究结果表明，细胞分裂素物质6-BA比TDZ更有利于提高西洋梨品种‘红考密斯的叶片不定梢再生率，这与6-BA能有效提高西洋梨‘丰产、‘安久、‘红安久梨叶片不定梢再生率的结果相一致[9，14]，但不同于已报道的其他西洋梨品种，如对于‘Louise Bonne Panachee和‘Seckel两品种，TDZ比6-BA更有效[2，15]；对于‘考密斯，诱导培养基单加TDZ比同时加BA和IBA显著提高再生率，最高再生率为70.8%[4]。Bell等[16]对22个西洋梨基因型的研究表明，西洋梨叶片不定梢再生率在0～87.7%之间，基因型是影响其不定梢再生及再生率高低的关键因素。

虽然报道成功获得叶片不定梢再生的西洋梨品种已有多个，但多数品种的平均每叶不定梢数很少。本研究中‘红考密斯梨每叶平均不定梢数也较少，最高仅为1.8个，且不定梢多产生于叶片中脉切口处，这与Bell等[16]的研究结果相似，均证明西洋梨离体叶片诱导虽然可以获得较高的不定梢再生率，但想获得较高的单位叶片不定梢数较困难。因此，如何提高单位叶片不定梢数需要进一步研究。

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