水稻羧酸酯酶基因OsCDAP的克隆及表达分析

李臻　潘教文　王庆国　刘炜

摘要：羧酸酯酶是一大类水解酶家族，催化短链脂肪酸酯键水解，在植物中参与除草剂代谢、信号分子激活、植物胁迫响应等过程。前期通过感染黑条矮缩病水稻数字表达谱鉴定到一个在病毒侵染后表达明显上调的羧酸酯酶基因。本研究以水稻中花11为材料克隆了该基因，将其命名为OsCDAP。生物信息学分析显示，该基因属于羧酸酯酶家族，与烟草中羧酸酯酶Nthsr203J的相似性最高，可达95%。组织表达模式分析显示，该基因在水稻茎中表达量最高，且为赤霉素诱导表达，并受赤霉素合成抑制剂PAC的抑制。该研究为进一步解析羧酸酯酶基因功能奠定了基础。

关键词：水稻；羧酸酯酶基因；OsCDAP；同源比对；组织表达；赤霉素

中图分类号：S511：Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0010-06

Abstract Carboxylesterases （CXE） belong to a large family of hydrolytic enzyme that catalyzed hydrolysis of short chain fatty acid ester. It were reported that CXE participated in herbicide metabolism， signal molecular activation and biotic stress responses in plants. In our previous research，a CXE gene was identified through RNA-seq， which could be induced to express under rice blacked streaked virus infection. In this research， the CXE gene named as OsCDAP was cloned from rice variety Zhonghua 11. Bioinformatics analysis showed that OsCDAP was homologous to the carboxylate enzyme Nthsr203J in tobacco with up to 95% identities. OsCDAP had the highest expression level in rice stem and was induced by GA and inhibited by GA inhibitor of PAC. This study laid the foundation for further analysis of CXE function.

Keywords Rice； Carboxylesterases gene； OsCDAP； Homologous comparison； Tissue expression； GA

羧酸酯酶（carboxylesterases， CXEs， e.c.3.1.1.2）是一大類水解酶家族，能催化短链脂肪酸三酯键水解，在动植物以及微生物中广泛存在，属于α/β水解酶折叠超家族[1]。该家族蛋白含有8个β折叠，及α螺旋和无规则环组成的保守核心区。CXEs包括稳定底物-酶中间体的氧负离子缝隙的三个甘氨酸和催化三元结构（丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸），也具有保守的激素敏感结构域HGG和GXSXG。

CXEs参与调控多种物质活性，在动物中参与神经的形成及发育调控、有毒物质的降解、信息素及激素的降解等生物学过程，与昆虫抗药性的形成密切相关，因此得到广泛关注。但是CXEs在植物中的鉴定及功能分析较少。Marshall等在拟南芥中鉴定了20个CXE基因，并分析了这些CXE基因的组织表达模式，同时结合已知的植物CXE基因序列，将CXE分为7类[2]；Newcomb在苹果中鉴定了16个CXE基因[3]；Islam等从葡萄科植物葛藟中鉴定了6个CXE基因[4]。已有部分CXE基因的功能得到初步验证，其中烟草Nthsr203J[5]、甜椒PepEST[6]、二穗短柄草BdCXE29[7]等基因均参与植物与病原物的互作；拟南芥AtCXE12参与除草剂代谢，对植物毒素具有解毒作用；番茄Lehsr203J能够通过水解茉莉酸甲酯和水杨酸甲酯成为有活性的茉莉酸和水杨酸，释放信号分子，调节植物生长发育[8]；辐射松PrMC3可能在细胞程序性死亡过程中发挥作用[9]。以上研究进展显示，CXEs在除草剂活性的调控、植物激素信号物质的活化、植物响应胁迫等过程中具有作用[10]。因此开展植物羧酸酯酶的研究，对于解析该类基因生物学功能具有重要意义。

课题组前期在水稻黑条矮缩病相关基因数字表达谱的基础上，鉴定到一个表达明显上调的基因，功能注释为羧酸酯酶17（CXE17）， KEGG预测其参与赤霉素合成和信号转导过程。本研究克隆了该基因，并将其命名为OsCDAP（LOC_Os11g04350），序列比对分析显示，该基因含有羧酸酯酶保守序列。该基因在水稻茎中表达量最高，为赤霉素诱导表达，并受赤霉素合成抑制剂PAC的抑制，推测该基因可能通过参与对赤霉素的响应从而参与水稻株高的调控。该工作对于完善羧酸酯酶家族研究，从而深入解析羧酸酯酶在植物中的功能具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物材料：水稻中花11种子由本实验室保存。

菌株与载体：农杆菌菌种LBA4404由本实验室保存；大肠杆菌DH5ɑ感受态购自Transgen公司（山东济南雨同生物科技有限公司）；克隆载体pMD18-T购自TaKaRa（日本）公司；植物双元表达载体p1301-bar-UBI由山东农业大学温孚江教授惠赠，该载体是以pCAMBIA1301为骨架改造而成，含有除草剂Basta筛选基因和单子叶植物Ubiqutin启动子。

主要试剂：限制性内切酶、T4 DNA ligase以及RNA反转录试剂盒PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A） 均购自TaKaRa公司（大连宝生物）；植物RNA提取试剂盒TransZol Plant （Code： ET101-01） 以及Taq DNA Polymerase购自Transgen公司；质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒购自博大泰克公司；荧光定量PCR所用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Code：13135900）试剂购自罗氏公司；除草剂PPT购自Sigma公司；除草剂Basta（有效成分PPT=18%）购自日本农药株式会社；所用引物均由上海英潍捷基公司合成；其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 RNA的提取及反转录

按照TransZol Plant试剂盒说明书提取水稻组织总RNA，并参照TaKaRa PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit試剂盒说明书将检测合格的RNA反转录合成第一链cDNA。

1.3 OsCDAP基因克隆及生物信息学分析

以反转录的水稻叶片单链cDNA为模板，根据OsCDAP基因的核苷酸序列（NCBI登陆号：XP_015615813.1），设计并合成特异性引物，OsCDAPF：5′-GCCAAGATAGCAAGAGAGTCC-3′； OsCDAPR：5′-GATAGCTGCACTCTGCACATG-3′，进行PCR扩增。反应条件为：94℃ 10 min；94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃延伸10 min。获得的DNA片段连入克隆载体pMD18-T中，经酶切鉴定后，阳性质粒由山东省农业科学院生物技术研究中心测序室进行序列测定。

利用水稻基因组注释网站Rice Genome Annotation Project （http：//rice.plantbiology.msu.edu）对OsCDAP的基因结构及编码蛋白基本信息进行分析。利用DNAMAN对该基因与已知CXE基因进行同源比对及保守区分析，利用BLAST进行序列比对；对获得的同源性较高的物种氨基酸序列，利用ClustalX进行氨基酸序列同源性分析，进而利用MEGA 5.0进行系统进化树分析。

1.4 OsCDAP组织表达及诱导表达模式分析

水培条件下生长4周的水稻幼苗，分别取其叶片、茎、根，大田中取水稻小穗和成熟种子，提取总RNA，以反转录产物为模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）为内参，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsCDAP基因在不同组织中的表达模式。

用10-6 mol/L的赤霉素喷施3周大的幼苗叶片，在处理后0、2、6 h和12 h分别剪取水稻叶片提取总RNA，另外用10-5 mol/L的赤霉素合成抑制剂PAC喷施3周大的幼苗叶片，在处理后0、6、12 h分别剪取水稻叶片提取总RNA，以反转录产物为模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）为内参，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsCDAP基因对GA及其抑制剂的响应模式。所用引物如下，OsACTINF：5′-TCGGCTACAACCCTGACAA-3′，OsACTINR：5′-CAAACTTGACGGCAATGTGG -3′；qCDAPF：5′-GTACCATTGGGGATGAACAA-3′，qCDAPR：5′-ACGGCGAAGAAGTTGAGATA-3′。

2 结果与分析

2.1 OsCDAP基因克隆及生物信息学分析

本研究以水稻中花11单链cDNA为模板，克隆了水稻羧酸酯酶家族基因OsCDAP。该基因全长1 071 bp，不含有内含子，编码357个氨基酸，等电点5.25，负电荷残基数（Asp+Glu）为48，正电荷残基数（Arg+Lys）为34，不稳定系数是46.07，属不稳定蛋白。该蛋白含有一个水解酶结构域，不含跨膜区，序列前端没有信号肽。与已知的拟南芥羧酸酯酶基因AtCXE17、烟草Nthsr203J、番茄Lehsr203J以及拟南芥赤霉素受体AtGID1A、AtGID1B、AtGID1C编码蛋白进行序列比对显示，OsCDAP编码蛋白含有羧酸酯酶的保守结构域HGG和GXSXG，以及丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸组成的催化三元结构，不具有赤霉素受体中GA结合所必须的精氨酸（R），说明OsCDAP编码具有水解活性的羧酸酯酶，但不属于GA受体（图1）。

同源比对分析显示OsCDAP编码蛋白与烟草中羧酸酯酶Nthsr203J的相似性最高，达到95%；进化树分析显示，OsCDAP编码蛋白与谷子和高粱中可能的CXE17的亲缘关系较近（图2）。

2.2 OsCDAP基因在水稻不同组织中的表达模式

以反转录产物为模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）为内参，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析基因OsCDAP的表达模式。以基因在叶中的相对表达量为参照，OsCDAP茎中的表达量相对较高，为43.72，其次在根中的表达量也较高，是叶中表达量的21.74倍，但是在种子中基本没有表达（图3）。结果显示，OsCDAP不是组成型表达。

2.3 OsCDAP的诱导表达模式

用10-6 mol/L的赤霉素喷施3周大的幼苗叶片，随着处理时间增加，OsCDAP的表达量逐渐增加，处理6 h后，基因的相对表达量为3.43；处理12 h时相对表达量为5.71（图4）。用赤霉素抑制剂PAC处理3周大的幼苗叶片，随着处理时间延长，OsCDAP的表达量逐渐下降，处理6 h，基因相对表达量为0.25；处理12 h时表达明显下调，基因相对表达量为0.14（图5）。结果显示赤霉素可以诱导OsCDAP基因的表达，且其表达受赤霉素抑制剂的抑制，说明该基因受到赤霉素的正向调控。

3 讨论

植物中CXEs蛋白存在保守的催化三元结构，即丝氨酸、酸性氨基酸和组氨酸形成的活性位点。其中酸性氨基酸通常为天冬氨酸，也有个别基因在此位点为谷氨酸（Glu），例如拟南芥的AtCXE15[2]。本研究选取不同物种中CXEs相关序列进行比对，结果显示，OsCDAP基因编码蛋白在该活性位点为保守的天冬氨酸。组氨酸和丝氨酸比较保守，但是对拟南芥的分析发现其AtCXE10、AtCE14和AtCXE19三个蛋白的保守组氨酸位置和大多数CXE不同，离蛋白羧基端较远，最终将其鉴定为赤霉素受体蛋白GID1s[11，12]。虽然OsCDAP结构域与GID1s的结构域相似，但是其不含有GA受体与GA结合的关键位点Arg265，而含有组氨酸活性位点，因此认为该基因是作为羧酸酯酶在植物体内发挥作用。

组织表达模式分析能够确定该基因的主要表达部位，从而为进一步分析其功能提供线索。利用半定量方法分析拟南芥中鉴定的20个CXE基因，发现其组织表达模式有很大差异：20个基因中的13个基因在所有检测组织中均有表达，另外7个基因中有4个基因（AtCXE7、AtCXE8、AtCXE13、AtCXE17）只在地上部分检测到表达，在根中未检测到表达；有2个基因AtCXE3、AtCXE9只在花和果实中表达，在其他组织中不表达；只有AtCXE1在各个检测组织中均未表达[2]。Souleyre等对苹果中两个CXE基因MdCXE1和MdCXE16在果实发育中的表达模式进行分析发现，MdCXE1在果实发育早期表达量低，在果实成熟时其表达量达到顶峰，并且其表达不受乙烯诱导；MdCXE16在整个苹果发育过程中表现为组成型表达，且受乙烯诱导表达13]。Stuhlfelder等从番茄中克隆并纯化了1个茉莉酸甲酯水解酶蛋白MJE，该蛋白在根和花中表达量较高，在茎和叶中表达量较低，当植株外源喷施茉莉酸后，该蛋白在1 h时下调[8，14]。总之植物CXEs组织表达模式复杂，有组成型，也有组织特异性的，显示CXEs可参与植物多种生物学过程并发挥作用。本研究中OsCDAP在茎中表达量最高，为叶中的40多倍、小穗中的10倍、根中的2倍，推测该基因在茎的发育及伸长等过程中发挥作用。

酯的水解顯著影响植物体内代谢物的生化活性，去酯化作用可以产生新的活性功能集团，从而进行后续化学修饰。许多植物信号分子在体内都是以酯类非活性的共价物形式存在，当植物需要时通过酯酶水解形成活性分子，CXEs蛋白就起到水解这些信号分子的作用，从而调节它们的活性，进一步影响植物的发育[15]。例如，CXEs可以将甲基化的水杨酸和茉莉酸酯水解释放出活性的水杨酸和茉莉酸[16]。玉米中的研究发现，IAA-肌醇磷脂的形成和水解受到一个CXE的调节，对于维系内源激素的动态平衡起重要作用[17]。赤霉素在植物体内也常常以糖酯化形式存在，在玉米中也可以被CXE水解而活化[18]。而且，赤霉素在生物体内也可以被甲基酯化，表明活性GA的产生也必须有甲酯酶的存在[19]。诱导表达分析显示，OsCDAP基因受赤霉素的诱导表达，受赤霉素合成抑制剂的抑制，显示该基因与GA合成及信号转导途径相关，它可能作为一种羧酸酯酶在赤霉素活性调控中发挥作用。相关功能待进一步研究。

参 考 文 献：

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