降解黄曲霉毒素B1芽孢杆菌的筛选与鉴定

王明清　张初署　于丽娜　毕洁　孙杰　赵红军　杨庆利　陈明学

摘要：本研究以香豆素为唯一碳源进行黄曲霉毒素B1（AFB1）降解菌的筛选，从花生地土壤中分离出高效降解AFB1的菌株A3042。研究该菌的上清液、菌悬液、胞内液对AFB1降解特性。结果表明，菌株A3042能高效降解AFB1，其胞外上清液、菌悬液和胞内液分别降解91.7%、11.4%和7.6%的AFB1，表明起降解的活性物质主要位于胞外液。综合其形态学特征、生理生化特征和16S rRNA基因分析，鉴定菌株A3042为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），命名为Bacillus cereus A3042。本研究为食品和饲料中AFB1的生物降解提供菌种资源。

关键词：黄曲霉毒素B1；降解；蜡样芽孢杆菌；鉴定

中图分类号：S182 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0071-05

Abstract In this study， the bacterial strain A3042 was isolated from the soil in Qingdao by screening with coumarin as the only carbon source. It could efficiently degrade aflatoxin B1（AFB1）.The degradation characteristics were studied in the supernatant， suspension and intracellular fluid. The results showed that the extracellular supernatant， bacterial suspension and intracellular fluid of the strain A3042 could respectively degrade 91.7%， 11.4% and 7.6% of AFB1， indicating that the main biodegradable active substance was in extracellular fluid. The strain A3042 was identified as Bacillus cereus and named as Bacillus cereus A3042 using morphological， physiological and biochemical features and 16S rRNA gene analysis. This study provided strain resource for the biodegradation of AFB1 in food and feed.

Keywords Aflatoxin B1； Degradation； Bacillus cereus； Identification

黄曲霉毒素（aflatoxin， AFT）是一类由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）等曲霉产生的一类毒素，其主体结构为二呋喃环和香豆素[1， 2]。黄曲霉毒素种类主要分为B族、G族和M族等，其中B族的黄曲霉毒素B1（AFB1）分布最广、危害最大，具有强烈的致毒性、致癌性、致突变性[3]。世界卫生组织人类致癌风险评价组将AFB1列为IA级危险物和I类致癌物[4]。AFB1主要污染花生、玉米等农产品，不仅对粮食和畜牧业造成巨大经济损失，也对人类和动物健康构成巨大威胁，严重危害人类食品安全和动物饲料安全。因而，去除花生、玉米等农产品中AFB1的污染，降低其在农产品中的残留，从而保障食品和饲料安全，对人和动物健康具有重要意义。

国内外众多研究人员致力于寻求有效去除AFB1的技术，目前去除方法主要分为化学法、物理法和生物法[5]。化学去除法主要通过化学反应如碱化、水解、氧化、还原等方法破坏AFB1的化学结构达到去除的目的，化学去除的方法有一定效果，但是存在去除不完全、容易造成营养物质损失等缺点[6]。物理法主要包括吸附剂吸附法、水洗法、挑选剔除法、加热去除法、紫外线去除法等[7， 8]，这些方法耗费大量人力物力，效率不高，并且會破坏农产品的营养成分。生物法主要分为生物吸附法和生物降解法。生物吸附法主要通过微生物细胞壁吸附AFB1[9， 10]，但是该方法是一个可逆的过程，吸附的毒素会再次释放出来；生物降解法主要将AFB1的分子结构破坏，产生降解产物，该过程是一种生物化学反应，不同于生物吸附[11]。近年来，生物降解AFB1引起了越来越多的关注，原因是生物降解法既避免了物理和化学方法破坏农产品和食品的营养，又具有降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点[12]。本研究通过初筛和复筛从花生地土壤中分离了一株高效降解AFB1的菌株A3042，并进一步分析了各组分降解AFB1的效率，通过细菌形态学观察、生理生化特征以及16S rRNA基因分析鉴定菌株A3042。本研究为去除食品和饲料中AFB1的生物降解提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤样品采集自山东省青岛市黄岛区花生地，香豆素购自上海融禾医药科技发展有限公司，AFB1标品购自Fermentek公司，色谱级甲醇购自Merck公司，细菌基因组DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，黄曲霉毒素免疫亲和柱购自北京华安麦科生物技术有限公司，Super GelRed荧光染色试剂购自US Everbright Inc，pMD18-T载体购自大连宝生物公司。

1.2 培养基

初筛培养基[13]（g/L）：0.25 g KH2PO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.5 g KNO3，0.5 g （NH4）2SO4，0.005 g CaCl2，0.003 g FeCl3·6H2O，1.0 g香豆素，2.0 g琼脂，pH 7.0，121℃高压灭菌15 min。