沙棘果油中棕榈油酸分离方法的研究

高山，王晶，刘暄，张泽生

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津300457）

棕榈油酸（palmitoleic acid）是一种16碳的单不饱和脂肪酸，双键位于碳端的第7个碳原子上（16∶1n-7）[1-2]，具有较好的稳定性。已有研究表明棕榈油酸可以缓解多种代谢疾病如肥胖、高血脂、高血糖和炎症等[2-7]。鉴于其良好的稳定性和调控代谢的功能性，开发棕榈油酸产品具有很好的市场前景。

棕榈油酸主要来源于鱼油等海产品。但由于渔业资源匮乏，棕榈油酸来源受到限制，难以满足市场的需求。因此，寻找富含棕榈油酸的来源并加以利用可以较好的弥补棕榈油酸产量的不足[2]。Badami等[8]通过研究多种植物的脂肪酸组成，发现澳洲坚果籽油中棕榈油酸含量较高，约为30%。另外，在昆士兰果和沙棘得果油中含量也很多，分别为17%和30%左右[9]。还有报道称猫儿屎籽（Decaisnea insignis）油中棕榈油酸的含量可达55.9%，以及在植物猫爪（Dolichandra unguis）的含量约64%[1]。在这些植物中，沙棘在我国分布最广，最具开发潜力。沙棘（HippophaerhamnoidesLinn.）是我国西部地区最具代表性的经济作物之一，这种植物具有极好的抗逆性，已经被应用于防风固沙和防治水土流失[10-12]。以沙棘果油为原材料分离棕榈油酸可以拓展棕榈油酸的来源，也为沙棘的高值化利用提供参考。

目前关于棕榈油酸分离方法的报道较少，奇拉达等[13]应用CO2超临界萃取法从沙棘果油中分离棕榈油酸，产物中棕榈油酸含量可达55.24%。张泽生等[14]应用分子蒸馏法富集沙棘果油中的棕榈油酸，其最高纯度达到51.9%。本研究在上述背景下，以沙棘果油为原料，对比分析使用CO2超临界萃取法、尿素包埋法和分子蒸馏法3种方法对分离效率的影响。在此基础上，建立了一种高效地从沙棘果油分离棕榈油酸的方法，即尿素包埋与分子蒸馏复合法，为沙棘果油深加工利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

沙棘果油由内蒙古鄂尔多斯高原圣果公司提供。实验使用的氢氧化钾、95%乙醇、无水硫酸铜、硫酸、盐酸、乙醚、石油醚、正己烷（均为分析纯）：天津化学试剂一厂。脂肪酸甲酯标准品购自Sigma公司。

1.2 主要试验仪器

7890A气相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；RE3000A型旋转蒸发器：亚荣生化仪器厂；SFE CO2超临界萃取仪：美国Thar科技公司；KDL-1短程分子蒸馏器：德国UIC公司；SHZ-Ⅲ循环水真空泵：亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 沙棘果油的皂化

称取20 g沙棘果油，加入2.2 g KOH和40 mL 95%乙醇。在75℃～80℃水浴中回流搅拌2 h～3 h。反应结束后，加适量蒸馏水，旋转蒸馏除去乙醇，加盐酸酸化至pH 2～3，转移至分液漏斗中静置分层。取上层有机相，用5%NaCl水洗至溶液pH值为中性，得到沙棘果油混合脂肪酸[2]。

1.3.2 沙棘果油脂肪酸的甲酯化

取脂肪酸200 g，置于10 mL具塞管中，加入2 mL 4%硫酸-甲醇溶液。在75℃水浴下反应1 h，反应完成后，加入2 mL正己烷和适量超纯水，静止待其分层。取上层正己烷相，用无水硫酸钠干燥，过0.22 μm的有机膜，置于4℃冰箱中待测[2]。

1.3.3 沙棘果油脂肪酸组成的气相色谱分析

采用Agilent 7890A气相色谱分析仪，氢火焰离子检测器对甲酯化的沙棘果油脂肪酸样品进行检测。色谱柱：HP-88（100 m×0.25 μm×0.2 μm）；进样口温度：245℃；检测器温度：250℃；流速：1 mL/min；分流比：30 ∶1；进样量：5 μL；升温程序如下所示：

以峰面积归一法计算各脂肪酸组分的相对含量。

以保留时间定性，峰面积归一化法计算各脂肪酸组分的相对含量。

1.3.4 CO2超临界萃取法

CO2超临界萃取法是利用CO2在特定压力和温度下形成超临界流体萃取分离脂肪酸的方法。在超临界状态下，将CO2超临界流体与待分离的物质接触，可以有选择性的把极性不同的成分萃取分离[15]。本试验采用SFE CO2超临界萃取仪对沙棘果油混合脂肪酸进行分离，分离条件为：萃取釜压力250 bar、萃取釜温度37℃、CO2流量 25 mL/min、萃取时间 1 h。

1.3.5 尿素包埋法

尿素包埋法是一种根据分子空间体积大小不同分离脂肪酸的方法，其原理是尿素在结晶过程中会形成具有一定空间体积的空腔，空间体积小的分子会被包合于空腔中，沉淀并析出。饱和脂肪酸没有碳双键，空间体积小易被包合；不饱和脂肪酸因具有双键会使得碳链弯曲，占用更大的空间体积，不易被包合。因此，饱和脂肪酸棕榈酸等通过尿素包埋被分离，可以提高棕榈油酸的含量。本操作具体步骤如下：尿素和95%乙醇按比例混合后，在80℃下搅拌回流，待尿素全部溶解后加入脂肪酸，充分混合，于80℃水浴继续回流1 h以上使尿素和脂肪酸充分混合，后将此混合溶液置于冷却循环器中包合结晶。包合一定时间后，迅速抽滤，分离滤液和滤渣。滤液和滤渣部分加入适量蒸馏水后加热溶解尿素，混合溶液出现分层。分别收集上层有机相，检测其中脂肪酸组成[16]。其中，尿素底物比例为 2 ∶1（g/g）、溶剂与尿素比例为 4 ∶1（mL/g）、尿素包埋时间为12 h。

1.3.6 分子蒸馏法

分子蒸馏法是利用不同物质的分子运动平均自由程的差异来实现分离的技术。在超真空条件下，分子量小、热运动程度剧烈的组分受热运动间距长可以达到冷凝面进行收集，从而实现混合物的分离。通过气相分析，发现棕榈油酸的出峰时间比多不饱和脂肪酸早很多，其分子量和热运动程度小，可以通过分子蒸馏进行分离，在超真空状态下脂肪酸分子受热发生热运动，根据热运动自由程的距离分离不同脂肪酸组分[17]。本试验采用KDL-1短程分子蒸馏器对沙棘果油混合脂肪酸进行分离，分离条件为：100℃蒸馏温度、0.1 Pa真空度。

1.3.7 尿素包埋-分子蒸馏复合法

先使用尿素包埋法处理沙棘果油混合脂肪酸，得到尿素包埋产物。应用分子蒸馏法对尿素包埋产物进行再分离，将两种方法的优点相结合，建立了一种高效的尿素包埋法-分子蒸馏复合法来分离沙棘果油中的棕榈油酸。两个试验阶段分别采用1.3.5和1.3.6所述条件进行分离。

1.4 数据分析

使用Excel 2016和SPSS 19.0对所得数据进行统计学分析，试验重复操作3次，结果取平均值，以“均值±标准偏差”（Mean ±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 沙棘果油脂肪酸组成分析

采用气相色谱对沙棘果油原料中的脂肪酸组成进行分析。结果如图1所示，原料中各脂肪酸组成为：肉豆蔻酸0.7%，棕榈酸32.9%，棕榈油酸35.5%，十七烷酸0.4%，硬脂酸0.9%，油酸15.3%，亚油酸8.6%，亚麻酸1.4%。

图1 沙棘果油脂肪酸气相色谱图Fig.1 The gas chromatogram of sea buckthorn fruit oil

2.2 CO2超临界萃取法、尿素包埋法和分子蒸馏法单独使用对分离产物中脂肪酸组成的影响

CO2超临界萃取法、尿素包埋法和分子蒸馏法分离沙棘果油中棕榈油酸的脂肪酸组成分析见图2，通过峰面积计算，各脂肪酸占总脂肪酸的比例列于表1，分析发现不同方法处理所得产物的脂肪酸组成有很大差异。

图2 3种方法所得产物气相色谱图Fig.2 The gas chromatogram of the production of the three extraction method

表1 3种方法分离产物中脂肪酸组成分析（M±SD，n=3）Table 1 The fatty acid composition analysis using three extraction methods（M±SD，n=3） %

CO2超临界萃取法的分离产物中棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸含量均出现少量下降，而棕榈油酸含量少量上升，这可能是因为CO2超临界流体极性与棕榈油酸较接近，使得棕榈油酸更容易被萃取出来。尿素包埋法的分离产物中棕榈酸和其他饱和脂肪酸含量大量降低，而油酸、亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸含量变化较小，这可能是因为尿素包埋去除了饱和脂肪酸使得棕榈油酸含量相对上升。分子蒸馏法的分离产物中，棕榈酸含量变化较小，油酸、亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸含量下降，这可能是因为分子蒸馏去除了一部分较高分子量的脂肪酸，使得棕榈油酸含量上升。另外，3种方法对分离得率也有一定影响，CO2超临界萃取法分离得率为62.6%，尿素包埋法分离得率为56.9%，分子蒸馏法分离得率为46.8%，这可能是因为分离成分不同，使得分离得率也出现相应变化。

2.3 尿素包埋-分子蒸馏复合法分离沙棘果油中的棕榈油酸

通过分析发现，尿素包埋法主要去除沙棘果油脂肪酸中的饱和脂肪酸部分，而分子蒸馏法主要去除较大分子量的多不饱和脂肪酸部分。结合这两种方法的优点，本论文提出了使用尿素包埋-分子蒸馏复合法分离沙棘果油中的棕榈油酸。如图3和表2所示，经过尿素包埋和分子蒸馏两步处理后棕榈油酸的含量达到73.4%，分离得率为26.3%。此方法可以作为分离沙棘果油棕榈油酸较为有效的方法。

图3 尿素包埋-分子蒸馏复合法所得产物气相色谱图Fig.3 The gas chromatogram of the production of the combination of urea complexation and molecular distillation

表2 尿素包埋-分子蒸馏复合法产物中脂肪酸组成分析（M±SD，n=3）Table 2 The fatty acid composition analysis of the combination of urea complexation and molecular distillation %

2.4 各分离方法得率、纯度及分离条件得分析

根据气相色谱的分析结果，在本研究中提出4种沙棘果油中棕榈油酸的分离方法，包括CO2超临界萃取法、尿素包埋法、分子蒸馏法和尿素包埋-分子蒸馏复合法结果见表3。

表3 3种分离方法的对比分析（M±SD，n=3）Table 3 Comparison of the three extraction method（M±SD，n=3）

对比4种方法的分离性能，结果如表3所示，尽管采用不同的方法都使得棕榈油酸的纯度得到提高，产生了富集效果。在这4种方法中，使用分子蒸馏法得到的产物分离得率和棕榈油酸纯度都较低；使用CO2超临界萃取法有最高的分离得率62.6%，但产品棕榈油酸纯度较低；而尿素包埋法可以达到最好的分离效果，分离得率可以达到56.9%，其中的棕榈油酸纯度也可以达到59.3%，使用尿素包埋-分子蒸馏复合法使得棕榈油酸含量得到进一步提高，但分离得率有所降低。

分析不同方法的分离条件，CO2超临界萃取法需要耐高压的设备和CO2气体，所需成本较高；分子蒸馏法分离过程中需要较高的真空度，温度要求不高，不需要萃取剂，对环境污染较小；尿素包埋法所需条件较温和，不需要复杂的设备，但其产生大量的尿素废料。尿素包埋-分子蒸馏复合法使得棕榈油酸含量得到提高，但分离得率较小，步骤相对繁琐。可以根据所需棕榈油酸含量和成本选择相应方法，以应对不同的生产需求。

3 结论

综上所述，本研究以富含棕榈油酸的沙棘果油为原料，对比分析使用CO2超临界萃取法、尿素包埋法、分子蒸馏法和尿素包埋和分子蒸馏复合法4种方法分离对所得各产物脂肪酸组成的影响。其中尿素包埋法去除了沙棘果油混合脂肪酸中的饱和脂肪酸部分；分子蒸馏法去除了较高分子量的多不饱和脂肪酸部分。综合这两种方法的长处，建立了尿素包埋和分子蒸馏复合法，可以得到棕榈油酸含量70%的分离物。另外，单使用尿素包埋法不需要特殊设备，所得分离物棕榈油酸含量也能接近60%，方便大规模生产。本论文研究结果可以为沙棘的高值化利用和棕榈油酸的工业化生产提供参考。

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