不同贮藏温度下养殖大黄鱼生物胺等品质变化规律研究

冯杰，王徐媛，傅玲琳，王翀，王海燕，王彦波，*

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.浙江工商大学浙江食品质量安全工程研究院，浙江杭州310018）

大黄鱼口感鲜美营养价值高，是我国东南沿海最具商业价值的海洋品种，深受消费者喜爱。大黄鱼死亡后，由于微生物的生长和酶的作用，体内一些蛋白质、氨基酸等含氮物质降解为生物胺、三甲胺等次级产物，使大黄鱼在感官及品质上发生一系列不可逆转的变化，这一过程即为腐败过程[1-2]。研究表明，温度是影响腐败过程的重要因素[3-5]。

生物胺是一类具有生物活性的小分子含氮化合物的总称，在微生物存在下，鱼体内游离氨基酸脱羧和转氨生成[6]。研究发现，生物胺的过量摄入对人体会造成损害[7-8]。国内外对淡水鱼及海水鱼贮藏过程中生物胺变化的研究很多：Fan等[9]测定青鱼不同贮藏温度下生物胺及其他品质指标，综合指标得出青鱼在20、4、0 ℃的货架期分别为 2、9、12 d。Shi等[10]将不同贮藏条件下白鲢生物胺及其他品质指标进行相关性分析，发现腐胺可作为白鲢鲜度指标。Rodrigues等[11]发现腐胺和尸胺可作为0℃贮藏条件下虹鳟鱼腐败过程的质量指标。作为重要的养殖鱼类，大黄鱼的新鲜度备受关注，而对于大黄鱼生物胺及品质相关性研究尚未见报道。因此对于大黄鱼贮藏过程中生物胺的变化研究具有重要的现实意义。鉴于此，本研究以养殖大黄鱼为对象，选择室温和冷藏两种典型的贮藏温度，即在25、4℃两种贮藏温度下，测定生物胺、菌落总数以及pH、挥发性盐基氮、三甲胺等品质指标，并解析相应的变化规律。此外，通过建立典型生物胺的多元回归预测模型，旨在阐释大黄鱼贮藏过程中品质指标之间的相互联系，为评价养殖大黄鱼不同贮藏温度下的品质变化规律及安全控制提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

养殖大黄鱼（354.1±12.1）g：宁波象山养殖场；生物胺标品（色谱级）、丹磺酰氯（色谱级）：美国Sigma公司；平板计数琼脂（Plate count agar，PCA）：青岛海博公司；乙腈（色谱级）、氨水（色谱级）：美国TEDIA公司；三氯乙酸、碳酸氢钠、碳酸镁及其他常规试剂：上海阿拉丁生化科技股份有限公司：实验用水为超纯水。

1.2 主要仪器与设备

1100高效液相色谱：美国Agilent公司；ST16R台式冷冻高速离心机：美国Thermo公司；LRH-250恒温培养箱：常州澳华仪器有限公司；DW-YL270低温冰箱：中科美菱公司；KJELTEC 8400全自动凯氏定氮仪：丹麦FOSS公司；FE20精密pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：上海博讯实业有限公司；Milli-Q超纯水处理系统：美国Millipore公司；722可见光分光光度计：上海光学仪器厂；MLS-3750高压蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

养殖大黄鱼分别装入无菌样品袋中，随机分成两组，分别放入4℃低温冰箱及25℃恒温培养箱中恒温贮藏。在贮藏过程中，根据预试验结果选择适当的时间间隔对样品取样分析。

1.3.2 生物胺含量测定

参照李志君[12]、G.Vinci[13]的方法略作修改，取5 g鱼肉，加入 10 mL 5%三氯乙酸（TCA），匀浆 2 min，室温下振荡提取60 min，4℃以3 600 r/min离心10 min，移出上清液后残渣重复提取1次，合并上清液并定容至20 mL，过滤。滤液与正己烷（1∶1，体积比）混合振荡，弃去上层有机相以除脂。除蛋白前加入氯化钠使之饱和，取5 mL试样，用氢氧化钠调节pH值至12.0左右，加入5 mL正丁醇/三氯甲烷（1∶1，体积比）混合液，涡旋振荡并离心，转移上层有机相，重复1次，合并萃取液，用正丁醇/三氯甲烷（1∶1）混合液定容至10 mL，取5 mL加入 300 μL 1 mol/L盐酸，混匀后用40℃水浴下氮气吹干，加入1 mL 0.1 mol/L盐酸溶解残留物。随后进行衍生过程，加入100 μL 2 mol/L NaOH溶液，再加入300 μL饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，继续加入2 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯（丙酮配制），在黑暗条件下40℃反应40 min，加入100 μL 25%氨水静置30 min终止反应。加入1.5 mL乙腈定容至5 mL，取1 mL试样过0.22 μm有机滤膜，待测。

色谱条件：Cl8 柱（300×4.6 mm×5 μm，Agilent）；流动相A为0.1 mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱，0 min～25 min，30%A→10%A；25 min～35 min，10%A。流速为0.8 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30℃；检测波长：254 nm。

1.3.3 其他品质指标测定

细菌总数（Total viable counts，TVC）测定参照 GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》，无菌条件下称取25 g去鳞去皮的鱼肉，加225 mL灭菌生理盐水搅拌1 min，并充分摇匀，之后逐级稀释至合适梯度倾注培养皿中混匀。挥发性盐基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）测定，按 GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》，使用全自动凯氏定氮仪测定。pH测定，按GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》，使用pH计测定。三甲胺（Trimethylamine，TMA）测定，按Dyer的方法[14]，称取5 g样品，加20 mL 5%TCA溶液，均质1 min，以4 000 r/min离心5 min，上清液过滤至50 mL定容瓶中，分别用20 mL，10 mL TCA溶液按上述操作提取两次，合并滤液定容至50 mL。取5 mL滤液与10 mL无水甲苯、1 mL碳酸镁-甲醛溶液和3 mL饱和碳酸钾溶液充分混合并静置10 min，吸出5 mL混合液与5 mL 0.02%苦味酸的甲苯溶液混匀，用分光光度计比色测定。

1.3.4 数据处理

试验重复3次，结果用平均值±标准偏差表示，数据统计分析用SPSSversion21作相关性分析，以P＜0.05作为差异显著的要求，采用Prism 7绘画软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏条件下大黄鱼生物胺含量变化

生物胺含量变化如表1所示。

表1 不同贮藏温度下养殖大黄鱼生物胺含量变化Table 1 Biogenic amines variation in large yellow croaker at different storage temperature

生物胺含量变化受温度影响很大，温度越高，生物胺变化越快。在25℃贮藏温度下，大黄鱼体内腐胺和尸胺增长显著，在贮藏终点分别达到75.56 mg/kg和806.00 mg/kg。腐胺和尸胺均是从24 h开始明显增长。而其他生物胺在贮藏过程中虽然略有增多，但是变化不明显。在4℃贮藏期间，腐胺和尸胺在贮藏前期增长缓慢，在第4天开始增长迅速，到达贮藏期终点时分别达到25.51 mg/kg和16.96 mg/kg，其他生物胺在贮藏期间也略有增加，但变化不大。在两种贮藏温度下，组胺含量到贮藏终点时分别为8.97 mg/kg，3.54 mg/kg，均未超过GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》对组胺含量≤200 mg/kg的限量。

2.2 不同贮藏条件下大黄鱼TVC变化

不同贮藏温度下养殖大黄鱼TVC变化见图1所示。

由图1可以看出，微生物的生长速度受温度影响很大。大黄鱼初始菌落总数为3.22 lg（CFU/g），在25℃贮藏条件下，菌落总数增长迅速，在18 h TVC就已超过5 lg（CFU/g）；4℃贮藏条件下的菌落生长速度次之，在第6天时达到5 lg（CFU/g）。根据SC 127-1984《鲜大黄鱼鲜小黄鱼》，大黄鱼一级鲜度标准为菌落总数≤4 lg（CFU/g），二级标准为菌落总数≤5 lg（CFU/g）。因此，25℃和4℃贮藏温度下大黄鱼的菌落总数分别在18 h和6 d时超出二级标准，判定为腐败。

图1 不同贮藏温度下养殖大黄鱼TVC变化Fig.1 TVC variation in large yellow croaker at different storage temperature

2.3 不同贮藏条件下大黄鱼TVB-N变化

大黄鱼在不同贮藏温度下的TVB-N值变化情况如图2所示。

图2 不同贮藏温度下养殖大黄鱼TVB-N变化Fig.2 TVB-N variation in large yellow croaker at different storage temperature

温度对大黄鱼TVB-N的影响很大。新鲜大黄鱼的初始TVB-N值为6.48 mg/100 g，随着贮藏时间的增长，两个贮藏温度下的大黄鱼TVB-N值均呈明显上升趋势，其中25℃贮藏条件下，大黄鱼TVB-N增加迅速，在接近贮藏终点36 h超过30 mg/100 g；其次是4℃贮藏条件，TVB-N先是平缓增加，而后接近贮藏终点时增加迅速，并在第10天达到31.8 mg/100 g，可能是由于随着贮藏时间的延长，微生物数量逐渐增多，在微生物作用下，大黄鱼体内氨基酸逐步降解成氨及其他胺类物质，TVB-N含量快速增加。根据SC 127-1984《鲜大黄鱼鲜小黄鱼》，大黄鱼一级鲜度标准为TVBN≤13 mg/100 g，二级标准为TVB-N≤30 mg/100 g。因此，25℃和4℃贮藏条件下，大黄鱼TVB-N含量分别在36 h和10 d超出二级标准，判定为腐败。

2.4 不同贮藏条件下大黄鱼pH值变化

大黄鱼不同贮藏温度pH值变化如图3所示。

图3 不同贮藏温度下养殖大黄鱼pH值变化Fig.3 pH variation in large yellow croaker at different storage temperature

在贮藏初期，两个温度下大黄鱼pH值都略有降低，随后25℃贮藏温度下大黄鱼pH值迅速上升；4℃温度下大黄鱼pH值上升一段时间出现小幅波动，而后继续上升，有可能是由于微生物处于对数末期，微生物生长活跃，并产生一些酸性代谢产物，之后由于继续降解鱼体内蛋白质而使pH值继续增长。

2.5 不同贮藏条件下大黄鱼TMA变化

大黄鱼不同贮藏温度下TMA变化如图4所示。

图4 不同贮藏温度下养殖大黄鱼TMA变化Fig.4 TMA variation in large yellow croaker at different storage temperature

新鲜大黄鱼初始TMA含量几乎为0 mg/kg，25℃贮藏温度下TMA升长迅速；4℃贮藏温度下TMA在贮藏初期平缓增长，接近贮藏终点时增长迅速，这和TVB-N的增长趋势相同。

2.6 生物胺变化与其他理化指标相关性

生物胺与TVC、pH值、TVB-N、TMA的相关性见表2所示。

根据表2测定的腐败指标结果，对不同贮藏温度下大黄鱼的生物胺和TVC、pH值、TVB-N、TMA进行皮尔逊相关性分析。结果表明，25℃和4℃贮藏期间，腐胺和尸胺与TVC、pH值、TVB-N、TMA这些品质指标都呈高度正相关。由生物胺产生情况来看，腐胺和尸胺在25℃和4℃贮藏过程中生成量大，变化趋势明显，且与各项品质指标高度相关。表明在这两种贮藏温度下，腐胺和尸胺与大黄鱼腐败过程关系紧密，可作为评价大黄鱼在这两种贮藏温度下品质的指标之一。

表2 生物胺与TVC、pH值、TVB-N、TMA的相关性Table 2 Correlation of biogenic amines and TVC，pH，TVB-N，TMA

为进一步探讨25℃和4℃贮藏温度下生物胺及其他品质指标之间的内部关系，分别以TVC、pH值、TVB-N、TMA为自变量，腐胺和尸胺为因变量进行回归分析，建立25℃和4℃的回归模型如图5所示。

图5 生物胺与其他品质指标回归方程Fig.5 Regression equations of biogenic amines and other quality indicators

其中，25℃贮藏温度下腐胺含量与各品质指标的回归系数由高到低分别为：TMA＞TVC＞pH值＞TVB-N（R2为0.750 2～0.963 5），尸胺含量与各品质指标的回归系数由高到低分别为：TMA＞pH值＞TVB-N＞TVC（R2为0.731 6～0.932 3），4℃贮藏温度下腐胺含量与各品质指标的回归系数由高到低分别为：pH＞TMA＞TVBN＞TVC（R2为 0.864 5～0.898 0），尸胺含量与各品质指标的回归系数由高到低分别为：TVC＞TVB-N＞TMA＞pH值（R2为0.803 5～0.915 9）。在 25℃和4℃储藏温度下大黄鱼体内腐胺和尸胺含量与各品质指标的回归系数均大于0.7，可以判定在大黄鱼的腐败过程中腐胺和尸胺与腐败进程有密切的关系，且腐胺和尸胺可作为判断大黄鱼腐败进程的指标之一。

2.7 生物胺预测模型

由表2得出，大黄鱼贮藏期间腐胺和尸胺与其他品质指标有着高度的相关性，因此可以用其他品质指标来表征生物胺含量，从而方便预测大黄鱼贮藏过程中生物胺的变化情况。将样本数据导入SPSS 21中，分析所有样本的腐胺、尸胺与TVC、pH值、TVB-N、TMA的Pearson相关性，均表现出有相关性（P均＜0.05，结果未列出），进而进行多元线性回归分析，建立回归方程。y1，y2，x1，x2，x3，x4分别代表腐胺、尸胺、TVC、pH 值、TVB-N、TMA，回归方程如下：

回归方程（1）的 R2为 0.915，P＜0.01，回归方程（2）的R2为0.766，P＜0.01。回归方程具有统计学意义，说明将TVC、pH值、TVB-N、TMA结合预测腐胺和尸胺效果较好。

模型验证另取一组两个温度下的贮藏大黄鱼各指标数据，随机选取15个数据代入上述公式求出预测值与原数据进行回归分析，结果如图6所示。

腐胺和尸胺回归系数R2分别为0.940和0.963，且用单变量线性模型检验拟合直线与方程y=x不显著，证明预测值与实际值差别不大，此模型可用于大黄鱼贮藏过程中腐胺和尸胺含量的预测。

图6 模型验证Fig.6 Verification of models

3 结果与讨论

生物胺是一类具有生物活性的含氮类化合物，不同水产品可生成的生物胺种类和数量都差别很大，组胺和酪胺具有毒性，而腐胺和尸胺的存在可能增加毒性作用[15]。而新鲜水产品体内不含或只含少量生物胺，其含量会随着水产品的死后贮藏而变化，因此，可以将生物胺作为水产品品质指标之一[16]。不同品种，或是不同来源的同一品种之间生物胺含量差异也很大，可能由于不同的生长环境或者不同微生物导致[17]。包玉龙等[18]研究发现鲫鱼在冷藏和冰藏过程中色胺和腐胺随时间增长明显；刘寿春等[19]分析罗非鱼在冷藏过程中，腐胺和尸胺快速增长；郭慧等[19]发现小黄鱼在不同贮藏环境下腐胺、尸胺、组胺和酪胺均随着贮藏时间而增加。本实验中，25℃和4℃贮藏环境腐胺和尸胺均增长明显，且25℃下尸胺含量达到806.00 mg/kg，可能是因为大黄鱼体内赖氨酸含量比较充裕且此温度适宜某些微生物生长，促进赖氨酸脱羧酶的活性。

微生物指标是衡量水产品新鲜程度的主要指标之一。水产品腐败过程中微生物的作用是最主要原因。大黄鱼贮藏过程中，25℃和4℃菌落总数均成S形生长曲线，可能是因为前期鱼体处于僵直阶段，蛋白质呈大分子状态，微生物无法利用，而后蛋白质被酶分解为小分子蛋白，微生物能够很好的利用，从而生长迅速[20]。在后期可能因为鱼体内营养物质限制，微生物生长速度降低。

TVB-N是在微生物作用下，大黄鱼体内蛋白质被分解成具有挥发性的氨、伯胺、仲胺等次级碱性含氮物质的总称[21]。TVB-N的含量通常被用于判定水产品腐败程度的指标之一[22]。此研究中TVB-N先慢后快的变化趋势与菌落总数变化一致，这是因为TVB-N主要受微生物的影响。Qin等[23]对草鱼的研究中，草鱼初始TVB-N含量为9 mg/100 g，本研究中大黄鱼初始含量6.48 mg/100 g与之一致，且都是高菌落总数时期对应高TVB-N含量。

pH值在一定程度上能反应水产在贮藏过程中的新鲜程度，新鲜鱼在死亡初期，体内发生糖原酵解，产生乳酸等酸性物质使鱼肉pH值降低，之后由于体内蛋白质在微生物作用下形成氨气及胺类碱性物质，导致pH值上升[24-25]。Alparslan等[26]认为，新鲜鱼体pH值在6.0～6.5之间，可接受的上限一般为6.8～7.0。此次研究中，大黄鱼贮藏初期pH值为6.16，与Alparslan观点符合，在贮藏终点时，4℃和25℃下大黄鱼pH值均略低于6.8，可能与品种、生活状态、季节等有关。

三甲胺是在水产品贮藏过程中，在腐败微生物作用下，使体内氧化三甲胺降解为三甲胺，是水产品腥臭味的主要来源，因此可以用来作为判断水产品的品质指标之一[27]。且TMA作为TVB-N的主要成分之一，其含量变化与TVB-N紧密联系[28]。在本次试验中，大黄鱼体内TMA含量在4℃及25℃均变化明显，变化趋势与OLA等[29]、Okoro等[30]结果一致，均是前期增长相对较慢，后期增长快速。

很多研究水产品保鲜技术，主要参照指标都为TVC、TVB-N、菌落总数等，对生物胺的影响往往单独研究，而生物胺产生与微生物活动相关联，因此是腐败过程不可忽视的指标。Bilgin等[31]通过研究几种水产品中生物胺形成和TBA、TVB-N、pH值及蛋白质的关系，发现TVB-N与尸胺、酪胺、组胺显著正相关；郭慧等[32]分析不同贮藏温度下小黄鱼、米鱼及带鱼生物胺与其他新鲜指标的相关性，得出3种海产品的特征生物胺；李苗云等[33]研究发现尸胺也作为判断猪肉腐败过程的重要变量。本实验中，通过多元回归分析发现腐胺和尸胺可作为大黄鱼腐败指标之一，且通过进一步的线性回归，建立了两种生物胺与其他品质指标的内在联系模型，并通过验证可用。

本文研究了两种贮藏温度下大黄鱼TVC、pH值、TVB-N、TMA的变化，得出25℃和4℃下大黄鱼的货架期分别为18 h和6 d。通过研究发现，温度对不同生物胺的影响差异也很巨大，对大黄鱼而言，腐胺和尸胺受温度时间影响最为显著，且温度越高产生越快。将腐胺和尸胺与其他品质指标做相关性分析，表明腐胺和尸胺与大黄鱼腐败过程关系紧密，可作为判定大黄鱼贮藏过程中品质指标之一。将腐胺和尸胺与其他品质指标建立多元回归方程，方程在统计学意义上显著，并对方程进行验证。可以更进一步阐明大黄鱼贮藏过程中腐胺和尸胺与腐败过程之间的关联，为以后对于生物胺形成机理的研究提供理论基础，对客观评价大黄鱼贮藏期间的品质变化及对其安全控制有重要意义。

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